Para empezar, tome los fragmentos de ADN de la escasa célula extraídos con biotina. Prepare una mezcla maestra agregando los reactivos para el relaves de dATP e incube la muestra durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Luego, inactive Klenow exo-menos incubando la muestra durante 10 minutos a 65 grados centígrados y enfriándola en hielo.
Después de lavar las perlas con 300 microlitros cada una de TB, NTB y 100 microlitros de tampón de ligadura, resuspenderlas en 50 microlitros de tampón de ligadura. Agregue cuatro microlitros de 15 micromolares de mezcla adaptadora prerecocida y un microlitro de 2000 unidades por microlitro de ADN ligasa T4 a la muestra. Lave las perlas con 400 microlitros de TB, 200 microlitros de NTB y 100 microlitros de tampón de restricción dos.
Después de amplificar la biblioteca por PCR, agrupe todas las reacciones de 50 microlitros de la misma muestra en un tubo de baja unión de ADN de 1,5 mililitros. Colóquelo en un imán de tubo y espere hasta que todas las cuentas estén pegadas a la pared. Transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 mililitros y rellene con tampón TLE a 500 microlitros.
Para realizar una selección de doble cara utilizando la purificación de perlas paramagnéticas, agregue 200 microlitros de perlas de stock a la biblioteca, mezcle por vórtice e incube durante 10 minutos, girando a temperatura ambiente. Luego, coloque la biblioteca en un imán y espere hasta que todas las cuentas estén pegadas a la pared. Transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 mililitros.
Concentre las perlas tomando 750 microlitros de perlas y colocándolas en un tubo de 1,5 mililitros en un imán. Una vez que todas las cuentas estén pegadas a la pared, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las cuentas mediante el vórtice en 300 microlitros de cuentas nuevas. Agregue 300 microlitros de perlas concentradas a la muestra.
Mezclar por vórtice e incubar durante 10 minutos, girando a temperatura ambiente. Colocar sobre un imán. Espere hasta que todas las cuentas estén pegadas a la pared y retire el sobrenadante.
Lave las perlas agregando un mililitro de etanol al 70% al tubo con las perlas aún en el imán. Deje que las perlas se sequen al aire y resuspenda en 21 microlitros de tampón TLE mediante vórtice. Para eludir la biblioteca de las cuentas, incubar la muestra durante 10 minutos a 37 grados centígrados en un termobloque.
Coloque el tubo en un imán y transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca a un nuevo tubo de unión baja de ADN de 1,5 mililitros.
