La regulación espaciotemporal precisa de los genes está controlada por diversos elementos reguladores de cis que interactúan entre ellos. Nuestro protocolo permite interrogar cuantitativamente los contactos de cromatina de loci seleccionados como promotores. Esta técnica nos permite identificar y cuantificar simultáneamente las frecuencias de interacción entre varios elementos reguladores.
Para generar cuerpos embrionados, comience por cultivar células madre embrionarias de ratón a 60% de confluencia. A continuación, retire el medio de cultivo y lave dos veces con dos mililitros de PBS esterilizado. Retire el PBS por completo y agregue dos mililitros de medio de desprendimiento de células.
Incubar el plato de cultivo a 37 grados centígrados. Después de la incubación durante cinco minutos, añadir ocho mililitros de medio de diferenciación DE EB al plato. Para disociar las colonias de mESC para obtener una suspensión de una sola célula, pipetee el medio hacia arriba y hacia abajo de 15 a 20 veces, y transfiera la suspensión a un tubo de 10 mililitros.
Centrifugar las células a 300 g a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante. Después de contar las células, resuspender el pellet celular con medio de diferenciación EB.
Invierta la tapa de un plato de cultivo de 15 centímetros. Usando una pipeta multicanal de 200 microlitros, deposite gotas de 20 microlitros de células resuspendidas en la tapa. Invierta la tapa cuidadosamente y colóquela en la parte inferior del plato de cultivo.
Incubar el plato con las gotas colgantes durante tres días. Para recoger las células después de la incubación, lave la tapa suavemente con 10 mililitros de PBS. Transfiera el PBS, que contendrá los EBs, a un tubo de plástico de 50 mililitros.
Después de dejar reposar el tubo durante 30 minutos a temperatura ambiente, retire cuidadosamente el sobrenadante. Los EBs se dejarán en la parte inferior del tubo. Resuspender suavemente los EB en 10 mililitros de medio de diferenciación de EB fresco.
Transfiera la suspensión a un plato petri bacteriológico de 10 centímetros. Tres a seis días después, utilice un microscopio invertido para verificar la formación de EB. Los EBs deben ser redondos y de tamaño homogéneo.
Recoger los EBs de dos o tres platos de 10 centímetros en un tubo de plástico de 50 mililitros. Centrifugar los EBs a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante y resusppend los EB en 10 mililitros de PBS.
Centrifugar los EBs a 300 g a temperatura ambiente de nuevo, esta vez durante tres minutos. Retire el sobrenadante y agregue dos mililitros de trippsina-EDTA al pellet. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante 15 minutos.
Durante la incubación, pipetear hacia arriba y hacia abajo cada tres minutos para obtener una suspensión de una sola célula. Para detener la reacción de la tripsina, añada ocho mililitros de medio de diferenciación de EB. Después de resuspender las células en un medio de EB fresco, agregue paraformaldehído a una concentración final de 1%Incubar las células durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo rotación.
Apagar el formaldehído añadiendo glicina a una concentración final de 0.125 molar. Complete el proceso de fijación como se describe en el manuscrito, y luego congele los gránulos celulares en nitrógeno líquido. Resuspender suavemente el pellet celular en un tampón de lysis helada recién preparado y colocar el tubo sobre hielo.
Después de 15 minutos, centrifugar las células a 1.000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 500 microlitros de tónifica fría. Resuspender el pellet en un tubo de 1,5 mililitros con 50 microlitros de 0,5% SDS en 1x tampón dos, y colocar el tubo en un bloque de calentamiento a 62 grados celsius.
Después de 10 minutos, retire el tubo del bloque de calentamiento y agregue el tampón de digestión. Mezclar bien por pipeteo, evitando la formación excesiva de espuma, e incubar el tubo a 37 grados Celsius. Para garantizar una digestión eficiente de las enzimas de restricción, en este protocolo, hemos incluido un paso repetitivo de la digestión.
Es por eso que también es importante resuspend bien los núcleos en el búfer de digestión. Agregue otros 25 microlitros de tampón de digestión, mezcle invirtiendo y tome ocho microlitros como control no digerido. Almacene la muestra de control no digerido en 20 grados Celsius negativos.
A continuación, añadirá varias alícuotas de la enzima de restricción Mbol, incubando a 37 grados Celsius bajo rotación después de cada alícuota. Tomar ocho microlitros como muestra de control digerida. Para descruciente ambas muestras de control, agregue 80 microlitros de tampón TE en 10 microlitros de proteinasa K.Incubar a 65 grados Celsius durante una hora.
Para comprobar la eficiencia de la digestión, ejecute alícuotas de 20 microlitros en un gel de 0,6%. Las digestiones exitosas muestran fragmentos principalmente en el rango de 3.0 a 5.0 pares de kilobases. Prepare el ADN para el cizallamiento como se describe en el manuscrito.
Utilice un sonicador para cortar el ADN a un tamaño de 150 a 700 pares de bases. Transfiera el ADN cizallado a un nuevo tubo de bloqueo seguro normal, agrupando múltiples sonicaciones de la misma muestra. Agregue perlas de purificación de ADN calentadas en una cantidad igual a 1,8 veces el volumen existente, y mezcle resuspending.
Después de cinco minutos de incubación, recoja las perlas con un bastidor magnético. Manteniendo los tubos en el bastidor magnético, lave las perlas dos veces con un mililitro de 80% de etanol recién preparado. Después de secar al aire las cuentas a temperatura ambiente durante dos o tres minutos, elula el ADN resuspendiendo las perlas en 1x tampón Tris.
Utilizando el método de caída colgante, se obtuvo una población homogénea de EBs seis días después de la inducción de la diferenciación ESC. La electroforesis de gel se realizó en todo el protocolo para el control de calidad. La digestión eficiente por Mbol resulta en fragmentos de menos de tres pares de kilobase.
La electroforesis después de la ligadura mostró que la mayoría de los fragmentos eran más grandes que tres pares de kilobases. Se esperan tamaños de fragmento de 400 a 500 pares base después de la sonicación. Después de la desfosforilación y la ligadura del adaptador de extremo único, se realizaron dos rondas de PCR para amplificar los objetivos de interés.
Cada objetivo se amplificó por separado con dos pares de imprimación diferentes, A y B para el locus Pou5f1 y C y D para el locus T. Esto dio lugar a un frotis de ADN alrededor de 400 pares de bases. Alternativamente, se realizó PCR multiplex para amplificar los objetivos A y C simultáneamente, resultando en un tamaño de fragmento similar después de la purificación.
En estos perfiles 4C, las cajas de color azul claro indican la ubicación de los potenciadores con cambios dinámicos durante la diferenciación. Las regiones de cromatina se contacta con los promotores de los genes Pou5f1 y T durante la diferenciación del EB. Pou5f1 se reguló durante la diferenciación de EB.
Por el contrario, T se reguló durante la diferenciación de EB. La digestión eficiente de las enzimas de restricción y luego la ligadura de proximidad del ADN genómico transversal son factores clave para asegurar el éxito de este protocolo. Otra cosa es el primer diseño para interrogar el mapa de contacto de cada locus.
Este procedimiento es ideal para interrogar el contacto con cromatina en loci dirigido. Si se requieren cambios globales, se podrían realizar enfoques de todo el genoma como Hi-C, captura de promotor Hi-C o HiChIP.
