Comience mezclando 200 microlitros de medios séricos reducidos con dos microgramos de cualquier ADN plásmido por separado en un tubo de microcentrífuga estéril uno. Repita esto para otros dos plásmidos en tubos separados. Luego, en el nuevo tubo dos, mezcle 200 microlitros de medios séricos reducidos con seis microlitros de reactivo de transfección y mezcle el contenido por pipeteo.
Incubar los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente antes de mezclar el contenido del tubo dos con el tubo uno. En tubos separados, repita la mezcla de los otros dos plásmidos con un reactivo de transfección. Incubar la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, en cuanto a gotas, agregue los complejos de transfección a las placas de imágenes de cultivo celular HeLa, asegurando una distribución equitativa en todo el plato. Una hora antes de la toma de imágenes, abra la válvula del tanque de dióxido de carbono y encienda el controlador ambiental para el microscopio. Usando las flechas hacia arriba y hacia abajo en el panel táctil, ajuste la temperatura a 37 grados centígrados y el dióxido de carbono al 5%Presione Establecer cuando haya terminado.
Para ajustar la configuración del láser, encienda el láser de luz blanca haciendo clic en la pestaña Adquirir y seleccionando Abrir vista general del láser. En el cuadro de diálogo, active el láser de luz blanca. Ingrese la potencia del láser como 85%Haga clic en el botón de control de excitación y seleccione la potencia máxima en el menú desplegable.
Comience el percolato de éster etílico de tetraetil rodamina o TMRE, experimente configurando el láser de excitación a 514 nanómetros y la ventana de espectros de emisión a 524 a 545 nanómetros para YFP. A continuación, para MitoTracker Deep Red, ajuste el láser de excitación a 641 y la ventana de espectros de emisión a 650 a 750 nanómetros. Del mismo modo, para TMRE, ajuste el láser de excitación a 555 nanómetros y la ventana de espectros de emisión a 557 a 643 nanómetros.
Comience la configuración de adquisición de imágenes seleccionando la pestaña Adquisición y ajustando el formato a 1024 por 1024. Ajusta la velocidad a 600 en el menú desplegable. Luego haga clic en el botón Promedio de línea y en el menú desplegable, seleccione tres.
Active el escaneo bidireccional y ajuste el factor de fase y zoom a 22,61 y 1,50 respectivamente. Una vez hecho esto, seleccione las celdas basadas en la señal fluorescente YFP haciendo clic en la configuración de YFP y presionando Fast Live. Luego ajuste la ganancia y la intensidad de YFP y luego seleccione las celdas en función de la señal fluorescente YFP.
Para obtener imágenes de la placa de control DMSO en el experimento TMRE, ajuste la ganancia y la intensidad de la señal TMRE configurando dos para que la intensidad de la red mitocondrial esté justo por debajo de la saturación. Mantenga constante la ganancia y la intensidad de TMRE. Luego ajuste la ganancia y la intensidad de la configuración del MitoTracker para que la red mitocondrial sea visible, pero tenue.
Una vez completados los ajustes de ganancia e intensidad, haga clic en Iniciar para adquirir una imagen. Adquirir imágenes de 20 células por condición experimental.
