Prepárese para la inmunotinción diseccionando la estría vascular del ratón y agregue el tejido a una placa de 24 pocillos que contiene 200 microlitros de paraformaldehído al 4% en 1X PBS. Incubar el tejido durante 20 minutos a temperatura ambiente. realizar dos lavados cortos de PBS 1X en un agitador orbital a bajas RPM.
Retire el PBS, luego realice la permeabilización y el bloqueo durante un mínimo de una hora a temperatura ambiente en 300 microlitros de solución de PBST. Luego, tiñe el tejido con el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego agregue un anticuerpo secundario e incube durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador orbital a bajas RPM.
Cubra la placa para proteger de la luz el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. A continuación, prepare un microportaobjetos más grande colocando dos pequeñas rayas de pegamento a lo largo del eje de 25 mm, un poco más pequeño que el deslizamiento de cubierta de vidrio de 18 por 18 milímetros. Coloque una gota de reactivo de montaje entre las rayas de pegamento.
Usando pinzas número 55, gabe la menor cantidad de tejido posible en un extremo del SV y transfiéralo de PBS al reactivo de montaje. Coloque un extremo del cubreobjetos en la corredera donde se colocó una raya de pegamento. Luego suelte suavemente el deslizamiento de la cubierta para evitar crear burbujas de aire.
Selle el soporte frotando una gota de esmalte de uñas transparente en cada esquina del soporte. Etiquete la muestra en el resbalón de la cubierta de vidrio, lejos del campo de visualización. Visualice el tejido SV bajo un microscopio de disección para asegurarse de que esté acostado y no cerca de ninguna burbuja de aire.
Si el tejido SV no está orientado correctamente, intente expulsar las burbujas de aire o retire con cuidado el deslizamiento de la cubierta de vidrio más pequeño y vuelva a colocar el SV. Se preparó una montura completa de SV del ratón P30 y se realizaron imágenes confocales. La expresión de ZsGreen se observó en las células intermedias, GSIB4 marcó las células endoteliales y DAPI marcó los núcleos.
