Comience a enfriar un molinillo de café comercial moliendo aproximadamente de 30 a 50 gramos de hielo seco dos veces, durante 30 segundos cada vez. Deseche el polvo de hielo seco y mezcle tres gramos de espaguetis de células de levadura congelados con aproximadamente 30 a 50 gramos de hielo seco en el molinillo de café preenfriado. Selle la unión entre la tapa y el molinillo con Parafilm.
Mezcle la mezcla de hielo seco de células de levadura 10 veces, durante 30 segundos cada una, dejando intervalos de 30 segundos entre cada ronda. Transfiera el polvo de hielo seco de células de levadura resultante a un vaso de plástico, usando una espátula limpia y seca. Después de la evaporación del hielo seco, agregue 2,25 mililitros de perlas magnéticas, o tampón MB, con inhibidores de proteasa y fosfatasa, al polvo de células de levadura.
Después de pipetear vigorosamente la mezcla de tampón celular, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, almacene el 0,1 % de las muestras de los extractos de células crudas para el ADN, y el 0,05 % de las muestras para el análisis de proteínas, a -20 grados centígrados. Transfiera la suspensión celular restante a tubos de reacción de dos mililitros de baja unión y separe los desechos celulares centrifugando los tubos.
Una vez hecho esto, coloque todos los sobrenadantes en un tubo cónico de 15 mililitros. De nuevo, almacene el 0,1% del sobrenadante a -20 grados Celsius para el ADN, y el 0,05% del sobrenadante para el análisis de proteínas. A continuación, lavar 500 microlitros de lodo magnético de perlas acopladas a inmunoglobulina G con 500 microlitros de tampón MB frío, que contiene inhibidores de proteasa y fosfatasa, dos veces, durante cinco minutos cada una, a cuatro grados Celsius, en rotación a 20 RPM.
Incubar las perlas magnéticas en 500 microlitros de tampón MB frío durante una hora a cuatro grados centígrados, en rotación a 20 RPM, antes de retirar el sobrenadante de las perlas con una rejilla magnética. Mezclar la suspensión de perlas magnéticas equilibrada con el lisado celular obtenido anteriormente y tirar de él en un tubo cónico de 15 mililitros. Después de incubar durante dos horas a cuatro grados centígrados y 20 RPM, transfiera la suspensión completa de lisado de células de perlas magnéticas a tubos de reacción de baja unión.
Separe las perlas magnéticas que llevan los anillos de cromatina de interés del lisado celular, utilizando una rejilla magnética. Transfiera el flujo restante de cada tubo a un tubo cónico nuevo de 15 mililitros, antes de almacenar algunas muestras a -20 grados Celsius para el análisis de ADN y proteínas. A continuación, suspenda la perla magnética de cada tubo cónico de 15 mililitros en 300 microlitros de tampón MB frío y combine las perlas en un tubo de reacción.
Realizar cinco lavados de 10 minutos cada uno, utilizando 750 microlitros de tampón MB frío, que contiene inhibidores de proteasa y fosfatasa, a cuatro grados centígrados, mientras se rota a 20 RPM. A continuación, realice el lavado final con 750 microlitros de tampón MB frío sin inhibidores de proteasa y fosfatasa. Suspender las perlas preparadas en 40 microlitros de tampón MB frío sin inhibidores de proteasa y fosfatasa.
