Este protocolo demuestra un método novedoso para multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae mediante la introducción de varios casetes de expresión en diferentes loci en un solo paso de transformación. Este enfoque de ensamblaje de plásmido libre de clonación para expresar una sola matriz de crRNA, conduce a un protocolo de edición del genoma rápido, eficiente y flexible. Diseñaremos células de levadura de tipo salvaje, para producir carotenoides mediante la introducción de genes heterólogos libres en loci genómico libre.
La matriz de crRNA única se compone de crRNAs individuales libres expresados desde el promotor libre de ARN polimerasa. Cas12a procesa in vivo la matriz crRNA en crRNA individuales. Los crRNAs guían a Cas12a a los loci objetivos en el ADN genómico donde Cas12a introduce roturas de doble hebra.
Los fragmentos de ADN hacia abajo se recombinan para la recombinación in vivo y se integran en el ADN genómico. Demostrar el protocolo estará Klaudia Ciurkot, una estudiante de doctorado. Jeffery van Wijk, Científico Asociado.
Y Brenda Vonk, científica asociada sénior de nuestro laboratorio. Después de obtener una sola matriz de crRNA para experimentos de edición del genoma multiplex de ADN sintético, prepare la mezcla de amplificación de PCR y cargue la matriz en el termociclador para la amplificación. Para analizar los productos de PCR por electroforesis, ejecute las muestras en un gel de 0,8% de agarosa a 5 V/cm durante 40 minutos.
Cargar la escalera de ADN con los fragmentos de ADN que van desde 100 10000 pares de base Luego purificar los productos PCR utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la transformación de la levadura, comience por pre-cultivar levadura de tipo silvestre en un matraz de 100 ml que contiene 20 ml de extracto de levadura de sintona dextrosa o medio YEPD. Para una incubación durante la noche, a 30 grados centígrados, y 250 rotaciones por minuto La mañana siguiente, inocular 20 ml de medio YEPD fresco con un volumen calculado de levadura pre-cultivo durante la noche.
Coloque el cultivo en una incubadora de agitación hasta que se alcance una densidad óptica de 1,0, medida a 600 nanómetros. Cosecha las células de levadura por centrifugación. Lavar el pellet de célula de levadura en 20 ml de agua desmineralizada a temperatura ambiente, seguido de una centrifugación adicional.
Resuspender el pellet en 100 microlitros de acetato de litio Solución Tris-EDTA, y transferir la levadura a un tubo de microcentrífuga. Mezclar cinco microlitros de ADN portador de una sola cadena y un microgramo de plásmido pCSN067 con la suspensión de la célula de levadura. A continuación, mezcle 600 microlitros de solución de polietilenglicol LiAc-TE con la muestra.
Incubar las células de levadura y el plásmido durante 30 minutos a 30 grados celsius y 450 prm en un bloque de calor de mesa. Al final de la incubación, mezclar 70 mL de dimetilsólfóxido con la solución de transformación. Caliente la mezcla durante 15 minutos en un baño de agua de 42 grados Centígrados.
Transfiera la mezcla a un tubo inferior redondo de 15 ml. Añadir 10 mL de YEPD al tubo para una incubación nocturna a 30 grados centígrados y 250 rpm. A la mañana siguiente, recoger las células transformadas por centrifugación, y aspirar todos menos los 200 microlitros finales del sobrenadante.
Resuspender el pellet de célula de levadura transformada en el sobrenadante restante. Placa 150 microlitros de la mezcla de transformación, y 150 microlitros de una dilución 20 veces de los 50 microlitros restantes de mezcla de transformación en YEPD, en placas de agar YEPD, complementado con 0,2 gramos por litro de G418. Después de 48 a 72 horas a 30 grados Celsius, elija un solo transformador para volver a rayar en una nueva placa de agar YEPD complementada con 0,2 g/L de G418.
Para la segunda transformación, haga crecer el cultivo a una densidad óptica a 600 nanómetros de 1,0, como acaba de demostrar. Y añadir 20 microlitros de células a un tubo de microcentrífuga. Después de la centrifugación, resuspender el pellet celular en 100 microlitros de la solución LiAc-TE, y añadir ssDNA.
En un tubo separado, combine un microgramo de la matriz de ARNrN, un microgramo del plásmido de receptor linealizado para la matriz de CRRNA, un microgramo de cada ADN de donante y un microgramo de cada región de flanqueo. A continuación, transfiera la mezcla de ADN al tubo de células de levadura competentes y complete la segunda transformación como se demostró para la primera transformación. A la mañana siguiente, recoger las células por centrifugación y resuspender el pellet en una pequeña alícuota de sobrenadante.
A continuación, la placa 150 microlitros de la mezcla de transformación, y 150 microlitros de una dilución 20 veces de la mezcla de transformación en el medio YEPD, sobre placas de agar YEPD suplementadas con 0,2 g/L G418, y 0,2 g/L de nourseothricina Después de 48 a 72 horas, a 30 grados centígrados, elija un solo transformador de color para re-rayar en una nueva placa YEPD para obtener colonias de un solo color. Para determinar la eficiencia de edición del genoma, cuente el número de colonias de color y blancas en las placas de transformación, y divida el número de colonias de colores por el número total de colonias. Para crear arte de píxeles de levadura, inocular matraces individuales de batido de 500 ml que contienen 100 ml de medio YEPD con tres carotenoides de diferentes colores que producen cepas S.cerevisiae, y un tipo salvaje CEN.
Cepa PK113-7D. Incubar los cultivos durante la noche a 30 grados centígrados con temblores a 250 rpm. Transfiera 0,5 ml de cada cultivo nocturno a tubos individuales que contengan 0,5 ml de medio de gradiente de densidad estéril no iónico por tubo, y mezcle brevemente las soluciones por vórtice.
Transfiera las suspensiones celulares a un depósito individual y calificado 2 por 3 pozos. Utilice un archivo csv con el ajuste de calibración de fluidos 6RES_AQ_GPSA2 en un instrumento de manipulador de líquido acústico para detectar 25 nanolitros de cada cepa S.cerevisiae desde la placa de origen de depósito calificada adecuada hasta una microplaca de destino de pozo 6144 que contenga 50 ml de agar YEPD. Cuando todos los pozos hayan sido vistos, incubar la microplaca a 30 grados Celsius durante 48 horas.
Para intensificar los colores de las cepas, guarde las placas de agar a 4 grados Centígrados durante al menos 72 horas. Una foto de Rosalind Franklin ha aparecido en el plato. Como se ha demostrado, el promotor, el marco de lectura abierto, el terminador y dos secuencias de conectores contiguos de 50 bp se pueden ensamblar en un casete de expresión a través de una reacción de clonación de Golden Gate y verificarse por PCR.
Después de la amplificación de la matriz de crRNA única por PCR, el plásmido receptor para la matriz de crRNA única se linealiza según lo confirmado por la electroforesis. La eficiencia de la Edición del Genoma Multiplex se puede calcular por el porcentaje de colonias de color después de la transformación, y por los resultados de los análisis de PCR que confirman la integración del ADN de los donantes en las ubicaciones de ADN genómico previstas. Por ejemplo, a partir de una imagen en blanco y negro de Rosalind Franklin, se creó una lista de imágenes y manchas de cuatro colores que luego se utilizó para detectar las cuatro cepas de levadura diferentes en una microplaca de agar a través de un manipulador de líquido acústico, como se demostró, lo que resultó en una pintura de levadura de alta resolución del científico.
Para esta transformación, utilice soluciones recién preparadas y fragmentos de ADN de alta calidad. Este método también se puede aplicar para la introducción multiplex de deleciones definidas y mutaciones puntuales en el ADN genómico. Además, se pueden realizar experimentos de regulación CRISPR.
Este método se puede modificar para introducir más que crRNAs libres dentro de una matriz para aumentar el número de modificaciones simultáneas que se pueden realizar.
