El envejecimiento se caracteriza por el deterioro dependiente del tiempo de múltiples procesos celulares que en última instancia aumenta la probabilidad de muerte del organismo. Dentro de una población, este proceso es variable y una serie de factores genéticos y ambientales pueden afectarlo. Una de las variables mejor estudiadas y entendidas es el papel de la dieta en la vida útil.
La restricción dietética es una intervención que, en última instancia, retrasa la aparición de cambios asociados al envejecimiento y al envejecimiento. Esto aumenta la vida útil y la salud de un organismo, o la longitud de tiempo cuando un organismo tiene una vida normal y saludable. Nuestro entendimiento actual ha llevado a la identificación de un conjunto distinto de cambios celulares que se han llamado las señas de identidad del envejecimiento, tales como la acumulación de mutaciones, la desregulación de los telómeros, la pérdida de la homeostasis proteica, problemas de respiración, y especies reactivas de oxígeno, entre otros.
Ahora gran parte de este entendimiento proviene de estudios que utilizan muchos organismos modelo diferentes. Ha habido muchas pantallas genéticas que han identificado genes que acortan y extienden la vida útil. Y estos incluyen estudios en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae, que es el foco de esta metodología, así como estudios en organismos multicelulares más complejos, como C.elegans y el sistema murino.
De estos, sin embargo, la levadura en ciernes es particularmente susceptible a estudios de envejecimiento debido a su corta vida natural y una serie de enfoques genéticos que pueden desentrañar las complejas relaciones genéticas, por lo que es un excelente sistema para la disección funcional de la genética del envejecimiento. La levadura se puede utilizar para estudiar varios aspectos diferentes del envejecimiento. Y nos centraremos en la vida cronológica, que es la duración que una célula puede sobrevivir.
El objetivo de este trabajo es presentar un enfoque genético sencillo para realizar una pantalla supresora de sobreexpresión. Utilizaremos un fondo genético que resulta en una vida cronológica anormalmente acortada. Y utilizaremos un enfoque específico para identificar genes que puedan rescatar o suprimir el fenotipo de vida útil acortado, tratando de identificar genes que restauran una vida normal.
El primer antecedente genético es una cepa de levadura con deficiencia de autofagia. La autofagia, que se traduce libremente como autocomiendo, es un sistema de degradación intracelular para entregar productos citosólicos, como proteínas y orgánulos, al lisosoma. Esto ayuda a mantener la homeostasis celular mediante la eliminación de proteínas dañadas, así como aquellas que han sobrevivido a su vida.
Trabajaremos con una cepa mutante que tiene una deleción del gen ATG1. ATG1 codifica para una proteína serina/threoína-proteína quinasa que se requiere para la formación de vesículas y la autofagia en la vía de orientación del citoplasma a vacuola. El mutante nulo ATG1 tiene un fenotipo de tener una vida cronológica anormalmente corta.
En este laboratorio de envejecimiento, diseñaremos y probaremos factores genéticos que puedan rescatar, o suprimir, la vida útil anormalmente acortada característica del mutante nulo ATG1. Sin embargo, esto también se puede ampliar a otros orígenes genéticos de corta duración. El primer paso en este proceso es identificar un gen que está relacionado con la prolongación de la vida útil.
Nos centraremos específicamente en los genes que extienden la vida cronológica cuando están sobre-expresados. Para ello, vamos a utilizar los datos disponibles públicamente que son accesibles desde la base de datos del genoma de la levadura. Vamos a subir aquí.
Búsqueda por fenotipo. Y a mitad de camino, veremos que podemos seleccionar la vida cronológica. Para buscar genes que aumenten la vida útil, lo que se puede ver es la gran cantidad de datos disponibles que tienen genes vinculados a este fenotipo en particular.
Hoy, vamos a estudiar SIR2, una histona lisina deacetilasa que está vinculada a una larga vida cronológica cuando está sobre-expresada. Lo primero que haremos es acceder a la secuencia de ADN para la región de codificación, así como a las regiones reguladoras que flanquean a ambos lados de este gen. Tomaremos 400 pares base aguas arriba y aguas abajo para asegurarnos de que abarcamos todas las regiones reguladoras.
Usaremos esta secuencia de ADN para diseñar imprimaciones PCR que nos permitirán clonar este gen en nuestro vector plásmido. Usaremos PCR para amplificar nuestro gen y clonarlo en el vector pRS315. Para ello, diseñaremos imprimaciones que contienen sitios de digestión de restricción que incorporan sitios de restricción HindIII y SacII.
Como pueden ver, el plásmido contiene ambos sitios de restricción, HindIII y SacII, que facilitarán nuestra clonación. Debe diseñar sus imprimaciones PCR para que contengan aproximadamente 21 o 22 nucleótidos de secuencia complementarios a la región que desea amplificar. Además de la secuencia, agregará en el extremo de cinco primos el sitio de restricción apropiado, ya sea HindIII en la imprimación delantera, o SacII en la imprimación inversa, que se muestra aquí en rojo y púrpura respectivamente, y más arriba de eso, añadir varios nucleótidos que permitirán que la enzima de restricción se una y cree el sitio de restricción de digestión con una mayor eficiencia.
Cultivar un cultivo de cinco mililitros de levadura de tipo salvaje durante la noche hasta la fase posterior al registro en medios enriquecidos, como YPAD. Cosecha ADN genómico utilizando un kit disponible comercialmente que es específico para el aislamiento genómico de hongos. Es importante que el kit sea específico para la levadura, ya que tienen una pared celular muy rígida y resistente para penetrar.
El tratamiento con zymolyase es eficaz para digerir la pared celular y aumenta considerablemente el rendimiento genómico. Utilice un espectrofotómetro para determinar la cantidad y la calidad del ADN. Para producir un amplón adecuado para la clonación, es necesario utilizar una polimerasa PCR de alta fidelidad para evitar mutaciones durante el proceso de amplificación.
Hay muchos kits de PCR de alta fidelidad diferentes que están disponibles comercialmente. Para facilitar la optimización de la reacción, recomendamos elegir un kit que proporcione varios sistemas de almacenamiento en búfer, uno que sea un búfer estándar de alta fidelidad, y otro optimizado para contenido de ALTO GC en amplicons complejos. Vamos a añadir 200 nanogramos de nuestro ADN genómico.
Vamos a añadir cinco microlitros de nuestro buffer. Vamos a añadir 2 microlitros de 1/2 de nuestros primeros delanteros y inversos. Vamos a añadir un microlitros de nuestra polimerasa, dos microlitros de DPP.
Y por último, vamos a QS toda la reacción a 50 microlitros con agua destilada estéril. Ejecutaremos la reacción de acuerdo con el protocolo específico para la enzima que estamos usando, así como para las imprimaciones que hemos diseñado en este experimento. Limpie y concentre la reacción PCR.
Cultivar un cultivo de cinco mililitros de E.coli durante la noche en medios selectivos. Pele el cultivo por centrifugación y deseche el sobrenadante. Resuspend y lyse las células en el búfer chaotrópico proporcionado durante cinco minutos.
Neutralizar la reacción y mezclar los dos por inversión cinco o seis veces. Centrifugar la muestra durante 10 minutos a la velocidad máxima. Transfiera el sobrenadante y a una columna de sílice y lave con el tampón proporcionado.
Deseche el flujo a través y repita el lavado con los otros tampones apropiados, con 30 segundos centrifugaciones en el medio, descartando su flujo a través de cada uno. Al final, centrifugar durante dos minutos más para eliminar cualquier etanol residual y eluir su plásmido en 20 microlitros tamamp buffer de elución y determinar la cantidad y calidad por espectrofotómetro. Ahora es el momento de configurar una digestión de restricción del vector y la inserción.
Añadir 625 nanogramos de ADN, ya sea el vector o el inserto, cinco microlitros de tampón CutSmart, un microlitr de SacII, un microlitro de HindIII, y QS la reacción con agua para llevar el volumen de reacción final a 50 microlitros. Incubar la restricción digiere a 37 grados centígrados durante tres horas, seguido de 80 grados centígrados durante 20 minutos para calentar y activar las enzimas. En este punto, los resúmenes se pueden almacenar en cuatro grados antes de continuar con el paso siguiente.
A continuación, vamos a configurar una ligadura de 15 microlitrotros usando nuestro fragmento genómico digerido, así como el vector que acabamos de completar. Vamos a empezar agregando seis microlitros de agua. Vamos a añadir dos microlitros de nuestro vector digerido.
Este es nuestro plásmido pRS315. Vamos a añadir cuatro microlitros de nuestro inserto, el gen SIR2. Vamos a añadir dos microlitros de nuestro búfer de ligasa, en caso de que el búfer 10X.
Y por último, vamos a añadir un microlitro de la ligasa. Vamos a incubar esto a 16 grados durante la noche, y luego matar el calor a la enzima a 80 grados centígrados durante 20 minutos. Para buscar nuestro plásmido creado con éxito, vamos a transformarlo en E.coli.
Vamos a usar 50 microlitros de células químicamente competentes. Vamos a descongelarlos en hielo, y tan pronto como se descongelen, vamos a añadir nuestra reacción de ligadura, vamos a agregar todo el contenido de la misma. Así que vamos a añadir 15 microlitros de la ligadura con la plaquita, y vamos a añadir 15 microlitros de nuestro control sin inserción, así como a una reacción separada.
Una vez añadido, deslice el tubo unas cuantas veces para mezclarlo. Y vamos a incubar esto en hielo. Después de completar la incubación de 30 minutos sobre hielo, vamos a añadir nuestras muestras en un bloque de calentamiento de 42 grados donde incubaremos y calentaremos el calor durante 20 segundos, punto que las sacaremos, y agregaremos medios de recuperación.
Después del choque de calor, vamos a permitir un período de recuperación. Vamos a tomar nuestras muestras y vamos a añadir 450 microlitros de medios SOC. Incubaremos estos a 37 grados centígrados para permitir la recogida de los plásmidos y para permitir que el gen de resistencia a la ampicilina comience a expresarse.
Permitiremos que estas muestras se recuperen a 37 grados durante 45 minutos. Después de esa incubación, establecemos una serie de diluciones, de una a 10, y de una a 100, y vamos a plancharlas en medios LB/Amp y permitir que las células crezcan de la noche a la mañana. Los plancharemos usando una técnica estéril.
Tomaremos la placa apropiada, que hemos etiquetado en consecuencia y contiene nuestro marcador seleccionable. Tomaremos 150 microlitros de nuestra E.coli transformada. Usando un bucle de inoculación estéril, luego extenderemos suavemente las células por toda la placa para obtener una buena distribución uniforme.
Una vez que hayamos terminado de enchapar todas nuestras diluciones, incubaremos estas placas durante la noche a 37 grados centígrados para ver qué crece. Después de un día, deberíamos ver colonias creciendo que con suerte contienen el plásmido que estábamos tratando de crear. Deberían parecerse a esto.
Usando una técnica estéril, inocular potenciales transformadores que crecieron de su transformación en cinco mililitros LB más ampicilina siguiendo el procedimiento previamente descrito. Aísle los plásmidos de cada potencial transformador y haga una digestión de restricción como se describió anteriormente. Ejecuta los productos de reacción en un gel de agarosa, comparando los potenciales transformadores con el vector vacío.
Guarde los transformadores que resulten en la escisión de una plaquita del tamaño adecuado para su estudio posterior. Después de haber creado con éxito nuestro plásmido, vamos a transformarlo en el fondo de levadura nula ATG1. Vamos a tomar 15 mils de células y vamos a peletizarlas, lo cual ya he hecho aquí.
Después de que se hayan peletado, retire los medios YPAD en los que estaban creciendo y lave las células con agua destilada. Después de eso, vamos a tomar las células y vamos a resuspendlas en 100 acetato de litio mililolar. Vamos a resuspenderlos en 200 microlitros de eso.
Resuspender el pellet celular por pipeteo suave arriba y abajo. Divida las células en tubos de microfure separados para cada una de las transformaciones que realizará, utilizando 50 microlitros de esta mezcla por transformación. A cada una de las transformaciones, necesitarás añadir 240 microlitros de 50%PEG.
PEG es muy viscoso, pipeta y medir con mucho cuidado. Mezclar por pipeteo después de la adición del PEG y después de cada uno de los componentes adicionales. A continuación añadir 36 microlitros de un acetato de litio molar, cinco microlitros de ADN esperma de salmón, u otro ADN portador, que ha sido hervido durante cinco minutos y colocado en hielo, y finalmente cinco microlitros del plásmido para cada transformación que va a realizar.
Vórtice cada tubo a fondo para mezclar. Incubar sus muestras a 30 grados centígrados durante 45 minutos. Calentarlos a 42 grados centígrados durante 10 minutos, y luego lavar las células una vez en agua estéril, finalmente resusppending en 200 microlitros de agua estéril.
Configure de una a 10 y de una a 100 diluciones de cada una de las cepas transformadas de levadura y placa 150 microlitros en SC menos placas leu para seleccionar para los plásmidos. Esparce las células de manera uniforme y uniforme, y deja que las placas se sequen antes de invertirlas e incubarlas a 30 grados centígrados, permitiéndoles crecer durante 48 a 72 horas. Una vez que hayamos clonado con éxito nuestro gen para probar, probaremos el efecto en la vida útil cronológica del organismo.
Creceremos la levadura, monitoreando el número de unidades formadoras de colonias viables que permanecen en función del tiempo. Cultivar la levadura primero durante 72 horas en SC menos medios líquidos de leucina con temblor a 30 grados centígrados. Usando un hemocitociómetro, determine la dilución necesaria para permitirle planchar 500 células.
Usando una técnica estéril, plaque las células en una placa SC menos leu, lo que le permite secar e incubar invertida durante tres días a 30 grados centígrados, momento en el que crecerán y se puede anotar el crecimiento de la colonia y registrar ese punto de tiempo. Después de hacer el plato, continúe incubando su levadura a 30 grados centígrados sin agitar. Inicialmente, repetimos el revestimiento a intervalos semanales, tomando puntos de tiempo más frecuentes si nuestros datos preliminares sugieren una supresión del fenotipo de envejecimiento.
Para determinar el porcentaje de viabilidad, normalizamos al día un punto de tiempo para el análisis. Asegúrese de encaplar la misma dilución en cada intervalo. Continúe con este proceso hasta que ya no vea ninguna colonia creciendo.
Es útil introducir su información en una hoja de cálculo de Excel. Esto le permitirá determinar rápidamente la viabilidad de cada cepa al final del experimento.
