Comience inoculando una sola colonia bacteriana en 200 mililitros de caldo Luria esterilizado en un matraz Erlenmeyer de 500 mililitros. Cultive las bacterias durante la noche en una incubadora agitadora a 37 grados. Después de 14 horas de cultivo, verifique la densidad óptica de las bacterias a 600 nanómetros.
Alicuente las bacterias en tubos cónicos de 50 mililitros y guárdelos a cuatro grados centígrados para su uso posterior. Con una pipeta serológica, transfiera 50 mililitros del cultivo bacteriano a un nuevo matraz Erlenmeyer de 250 mililitros Etiquete los tubos para control vivo o simulado. Utilice una pipeta serológica para transferir 50 mililitros de la bacteria a un tubo cónico de 50 mililitros para el control simulado antes del lavado.
En la campana química, agregue 781 microlitros de paraformaldehído al cultivo bacteriano para lograr una concentración final de 0.5%Deseche la punta usada en un contenedor de riesgo químico de desechos sólidos. A continuación, cubra el matraz con una hoja de papel de aluminio y colóquelo en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante una hora. Una vez completada la incubación, lave las bacterias para eliminar cualquier residuo de paraformaldehído.
Para la eliminación del paraformaldehído residual, mediante una pipeta serológica, transfiera las bacterias tratadas del matraz Erlenmeyer a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, centrifugar las bacterias tratadas a aproximadamente 3000 G durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante en un contenedor de residuos líquidos peligrosos para productos químicos dentro de la campana química.
Ahora agregue 25 mililitros del caldo Luria a los gránulos bacterianos tratados y controlados, y vórtice para resuspender los gránulos bacterianos. Repita la centrifugación y la resuspensión de pellets cuatro veces. En preparación para varios ensayos, vuelva a suspender el gránulo en volúmenes adecuados.
Para ensayos de vida útil. Siembre 200 microlitros de bacterias resuspendidas en 10 mililitros de caldo Luria en platos de 60 milímetros. Almacene las bacterias a cuatro grados centígrados.
Para realizar un control de calidad del crecimiento bacteriano, raye una placa de caldo Luria con una bacteria preparada con una punta de pipeta estéril. Para verificar la contaminación, coloque el caldo Luria utilizado para lavar y volver a suspender en un plato aparte. A continuación, coloque las placas en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, compruebe si hay crecimiento bacteriano. Guarde las bacterias si la preparación del aldehído paraformado es exitosa y las colonias no crecen en la placa LB. Para comprobar la actividad metabólica bacteriana con un respirómetro, primero hidrate el cartucho añadiendo 200 microlitros de calibrante a todos los pocillos en una placa de 96 pocillos.
Coloque el cartucho en la placa de 96 pocillos e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Configure la máquina para mezclar, pesar, medir y hacer un bucle. Al día siguiente, coloque el cartucho hidratado en la máquina.
A una nueva placa de 96 pocillos, agregue 160 microlitros de M9 a los pocillos de prueba, seguidos de 40 microlitros de bacterias preparadas. Agregue 200 microlitros de M9 en los cuatro pozos de las esquinas para que actúen como espacios en blanco. Dispensar 160 microlitros de M9 y 40 microlitros de caldo Luria como controles negativos.
Finalmente, pipetee 200 microlitros de M9 en los pocillos restantes no utilizados. A continuación, sustituya la placa de calibración expulsada por la placa de ensayo antes de ejecutar el programa. Los resultados se mostrarán como la tasa de consumo de oxígeno.
Diferentes cepas exhibieron diferentes tiempos de respuesta de inactivación al paraformaldehído. Por ejemplo, la exposición de la bacteria HB101 al 0,25% durante una hora es suficiente para hacerla metabólicamente inactiva. Enterococcus faecalis requirió una concentración del 1,0% para un efecto consistente.
Los gusanos Caenorhabditis elegans mostraron preferencias similares hacia las cepas OP 50 tratadas, así como hacia el control tratado simulado. Sin embargo, un ensayo sensible por pares reveló una mayor preferencia por el control simulado. Los gusanos en el OP 50 tratado tienen una tasa de bombeo más alta que los gusanos en el control tratado simulado.
El consumo de bacterias tratadas dio lugar a un retraso en el tiempo de desarrollo de los gusanos de tipo salvaje, así como a una disminución de la capacidad de puesta de huevos. La vida útil de los gusanos no fue significativamente diferente entre sí, independientemente de la fuente de alimento. Sin embargo, las bacterias tratadas con paraformaldehído aumentaron la vida útil del gusano en presencia de 5-fluoro-2'desoxiuridina El consumo de las bacterias tratadas con paraformaldehído por una cepa de gusano de larga vida no alteró su longevidad.
