עבודה זו מומנה על ידי NIH R21AG059117 ומעבדות פול פ. גלן לביולוגיה של חקר ההזדקנות באוניברסיטת מישיגן. SB מומן על ידי T32AG000114. ESK מומנה על ידי NSF DGE 1841052.

1. חיסון חיידקים
<ol><li>הכינו ציר לוריא (LB) על ידי המסת 10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים ו-10 גרם נתרן כלורי (NaCl) ב-950 מ"ל מים מזוקקים.</li>
	<li>התאם את ה- pH של LB ל- 7.0 על ידי הוספת 5M נתרן הידרוקסידי (NaOH). זה צריך לדרוש רק כ 0.2 מ"ל של NaOH.</li>
	<li>בצע Autoclave של מדיית LB מותאמת pH במחזור נוזל למשך 45 דקות ב- 15 psi. אפשר לתמיסה להתקרר ולאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>חסן מושבה אחת של חיידקים ב 100 מ"ל של LB בבקבוק Erlenmeyer 500 מ"ל. תרבית את החיידקים למשך הלילה באינקובטור שייקר של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בהתאם לבריאות מושבת החיידקים, גודל הבקבוק והמהירות אליה מכוון השייקר, הזמן שלוקח לחיידקים לגדול עשוי להשתנות. לאחר ~14 שעות, בדוק את הצפיפות האופטית (OD) של החיידקים ב- 600 ננומטר (OD600).</li>
	<li>הסר את החיידקים מהשייקר כאשר OD600 הוא 3.0 (1 x 109 יחידות יוצרות מושבה (CFU)/מ"ל). אם OD600 קטן מ- 3.0, החזר את הבקבוק לאינקובטור השייקר עד שתגיע ל- OD הרצוי.</li>
	<li>Aliquot את החיידקים ב 50 מ"ל צינורות חרוטי ולאחסן ב 4 °C או להמשיך לשלב הבא.</li>
</ol>2. עבודה עם paraformaldehyde
הערה: ריכוז הפרפורמאלדהיד (PFA) שבו נעשה שימוש, ומשך החשיפה עשויים להשתנות במידת מה בהתאם לאקלים, מיקום וסוג החיידקים המטופלים. נקודת התחלה טובה עבור OP50 היא חשיפה ל-0.5% PFA למשך שעה אחת, בעוד ש-0.25% PFA למשך שעה אחת עשוי להספיק עבור HT115.
<ol><li>הכן מלאי PFA של 32% או השתמש בפתרון PFA 32% שנרכש באופן מסחרי. השתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) בעת עבודה עם PFA. יש ללבוש כפפות והגנה על העיניים.</li>
	<li>יש להוסיף PFA בתוך מכסה אדים כימי עם אוורור מתאים. יש להשליך את ה-PFA המכיל שטיפות וקצוות במיכלים מתאימים לסיכון כימי במכסה האדים.</li>
</ol>3. טיפול חיידקי עם paraformaldehyde
<ol><li>ברגע שהחיידקים מגיעים ל-OD600 של 3.0, השתמשו בפיפט סרולוגי כדי להעביר 50 מ"ל לתוך בקבוק חדש של 250 מ"ל Erlenmeyer. שמור את השאר עבור פקד חי, פקד מטופל דמה (ראה שלב 4), או כדי לטפל גם עם PFA לפי הצורך.</li>
	<li>הימנעו ממזיגה מבקבוק אחד למשנהו והיזהרו שלא להתיז את דפנות הבקבוק החדש בחיידקים. מושבות בצד הבקבוק עשויות לקבל מינון נמוך יותר של PFA.</li>
	<li>במכסה המנוע הכימי, הוסף 781 μL של 32% PFA לחיידקים 50 מ"ל כדי להביא את הריכוז הסופי ל -0.5%. יש להשליך את החוד המשמש במיכל מסוכן כימי מפסולת מוצקה.</li>
	<li>מכסים את הבקבוק בנייר כסף וחוזרים לאינקובטור השייקר של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר 1 שעה, להסיר את הבקבוק מן האינקובטור ולהמשיך לשלב 5.</li>
</ol>4. שליטה מטופלת דמה
<ol><li>ברגע שהחיידקים מגיעים ל-OD600 של 3.0, השתמשו בפיפט סרולוגי כדי להעביר 50 מ"ל של החיידק לצינור חרוטי של 50 מ"ל.</li>
	<li>המשך לשלב 5.3 כדי להשלים את שלבי הכביסה בדומה לקבוצה שטופלה ב- PFA.</li>
</ol>5. שטיפת החיידקים כדי להסיר שאריות PFA
<ol><li>במכסה המנוע הכימי, השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר את החיידקים המטופלים מבקבוק Erlenmeyer לצינור חרוטי 50 מ"ל. שימוש בפיפטה סרולוגית במקום לשפוך את החיידק ימנע זיהום מכל מושבות חיידקים בשולי הבקבוק שאולי נמנעו מטיפול ישיר ב- PFA.</li>
	<li>צנטריפוגה טיפלה בחיידקים בערך 3000 x גרם במשך 20 דקות. הסר את הסופרנאטנט על ידי השלכתו במיכל סיכון כימי לפסולת נוזלית במכסה המנוע הכימי.</li>
	<li>הוסף 25 מ"ל של LB ומערבולת כדי להשהות מחדש את הגלולה החיידקית (מילוי הצינור במלואו מקשה על השעיית הכדורית). צנטריפוגה חוזרת ומתלה כדורי 4x.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה בנפחים אופטימליים לבדיקות שונות. עבור בדיקות תוחלת חיים, זרע 60 מ"מ לוחות עם 200 μL של חיידקים resuspended ב 10 מ"ל של LB. השעיה מחדש של החיידקים ב 10 מ"ל של LB מביא לריכוז 5x מן התרבית המקורית 50 מ"ל.</li>
	<li>אחסנו את החיידקים בטמפרטורה של 4°C.</li>
</ol>6. בדיקת איכות של צמיחת חיידקים
<ol><li>לאחר השטיפה הסופית וההשעיה, פזרו צלחת LB (באמצעות קצה פיפטה סטרילי) עם החיידקים המוכנים. זה נוהג טוב לפזר את LB המשמש לשטיפה ו resuspending על צלחת נפרדת, כמו גם כדי לוודא כי LB בשימוש לא היה מזוהם.</li>
	<li>מניחים את הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בדוק אם יש גידול. החיידקים נחשבים למתים באופן כפול כאשר מושבות אינן גדלות על צלחת LB.</li>
</ol>7. בדיקת איכות חילוף החומרים של חיידקים באמצעות רספירומטר
<ol><li>לאחר השטיפה הסופית וההשעיה משלב 5.4, ודא שהחיידקים מתים מטבולית באמצעות כלים זמינים כגון ספירומטרים19,20 ומדידת קצב צריכת החמצן הבסיסית (OCR).</li>
	<li>הכנת תמיסת M9: המסת 3 גרם אשלגן פוספט חד-בסיסי (KH 2 PO 4),6 גרם נתרן פוספט דיבסיסי (Na2HPO4), ו-5 גרם נתרן כלורי (NaCl) ב-950 מ"ל מים מזוקקים. Autoclave על מחזור נוזל במשך 45 דקות ב 15 psi, ולאחר מכן לאפשר את הפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר. יש להוסיף 1 מ"ל של מגנזיום גופרתי בנפח 1 מ"מ (MgSO4) ולאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לחות את מחסנית הרספירומטר: הוסף 200 μL של כיול לכל הבארות של צלחת 96 בארות. מניחים את המחסנית בצלחת 96 בארות ודגרים למשך הלילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כיול מבחן: ביום המחרת, הכנס את המחסנית המיובשת למכונה והתחל בכיול.</li>
	<li>הגדרת צלחת בדיקה: באמצעות צלחת חדשה של 96 בארות, הוסף 160 μL של M9 ו- 40 μL של החיידקים המוכנים (1 x 109 CFU/mL) כדי לבדוק בארות. הוסף 200 μL של M9 לארבע הבארות הפינתיות לשימוש כבארות ריקות. הוסף 160 μL של M9 ו- 40 μL של LB המשמש לשטיפה והשהייה מחדש לשימוש כבקרות שליליות. הוסף 200 μL של M9 לשאר הבארות שלא ישמשו.</li>
	<li>הפעל את הבדיקה: לאחר השלמת כיול המחסנית, הכנס את לוחית הבדיקה משלב 7.5 למכשיר לצורך ניתוח. ההגדרות כוללות שלבים לערבוב, המתנה, מדידה ולולאה. התוצאות יוצגו כקצב צריכת חמצן (OCR). החיידקים מתים מטבולית ומוכנים לשימוש כאשר זיהוי תווים אופטי (OCR) הוא אפס.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65775/65775fig01.jpg"> איור 1. זרימת עבודה לטיפול paraformaldehyde. מושבה אחת של חיידקי E. coli OP50 גדלה בן לילה. PFA מתווסף לריכוז סופי של 0.5%, והתרבית שטופלה ב- PFA מזועזעת במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, PFA מוסר על ידי שטיפת התרבית עם LB 5x טרי. כדי לוודא שהחיידקים המטופלים אינם פעילים באופן משכפל, הוציאו צלחת LB של החיידקים המטופלים וגדלו בן לילה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65775/65775fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

השבתה מטבולית חיידקית ב Caenorhabditis elegans באמצעות Paraformaldehyde

<ol>
	<li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Elegans II. 33, (1997).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+primer+on+caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+function+in+novel+targets:+C.+elegans+as+a+model+organism.">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).</li><li>Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+worms:+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+organism.">Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).</li><li>Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+useful+model+for+studying+aging+mutations.">Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).</li><li>Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota-derived+metabolites+in+regulating+the+development+and+physiology+of+Caenorhabditis+elegans.">Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).</li><li>McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+FUdR+on+gene+expression+in+the+C.+elegans+bacterial+diet+OP50.">Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).</li><li>Cabreiro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+retards+aging+in+c.+Elegans+by+altering+microbial+folate+and+methionine+metabolism.">Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism.</a> Cell. 153 (1), 228-239 (2013).</li><li>Worthy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+attractive+odorants+released+by+preferred+bacterial+food+found+in+the+natural+habitats+of+c.+Elegans.">Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans.</a> PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).</li><li>Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microbial+metabolite+synergizes+with+endogenous+serotonin+to+trigger+C.+elegans+reproductive+behavior.">A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).</li><li>Kim, D. H., Flavell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-microbe+interactions+and+the+behavior+of+Caenorhabditis+elegans.">Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).</li><li>Gems, D., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic,+behavioral,+and+environmental+determinants+of+male+longevity+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).</li><li>Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vitamin-b2-sensing+mechanism+that+regulates+gut+protease+activity+to+impact+animal's+food+behavior+and+growth.">A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth.</a> eLife. 6, e26243 (2017).</li><li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+caenorhabditis+elegans:+A+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation.">Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).</li><li>Virk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+acts+in+E.+coli+to+accelerate+C.+elegans+aging+independently+of+bacterial+biosynthesis.">Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis.</a> Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).</li><li>Beydoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+food+source+for+metabolism+and+longevity+studies+in+Caenorhabditis+elegans.">An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans.</a> Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).</li><li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation.">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li><li>Felix, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilized+and+immobilized+cells.">Permeabilized and immobilized cells.</a> Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).</li><li>Lobritz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+efficacy+is+linked+to+bacterial+cellular+respiration.">Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).</li><li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform.">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li><li>Shtonda, B. B., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+choice+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).</li><li>MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+developmental+acceleration+independent+of+tor+and+insulin+in+C.">Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C.</a> elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+C.+elegans+caused+by+bacterial+colonization+of+the+intestine+and+subsequent+activation+of+an+innate+immune+response.">Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response.</a> Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+sbt2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Kaeberlein, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food.">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).</li><li>Beaudoin-Chabot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response+reverses+the+effects+of+glucose+on+lifespan+in+chemically-sterilized+C.">The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C.</a> elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).</li><li>Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+lifespan,+improved+perception,+and+enhanced+host+defense+of+Caenorhabditis+elegans+by+Lactococcus+cremoris+subsp.">Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp.</a> cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).</li><li>Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pharmacological+network+for+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans.">A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).</li><li>Hastings, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wormjam:+A+consensus+C.+elegans+metabolic+reconstruction+and+metabolomics+community+and+workshop+series.">Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series.</a> Worm. 6 (2), e1373939 (2017).</li><li>O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour.">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li><li>Stuhr, N. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diets+differentially+alter+lifespan+and+healthspan+trajectories+in+C.+elegans.">Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans.</a> Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cembio+-+the+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

היתרונות של הרג PFA ביחס לשיטות הרג חיידקים אחרות טיפול PFA הוא שיטה בעלת תפוקה גבוהה למניעת חילוף חומרים חיידקי תוך שמירה על מקור מזון מזין עבור C. elegans. להרג חיידקים באמצעות טיפול PFA יש יתרונות רבים על פני שיטות אחרות. שלא כמו טיפול UV, שבו כל צלחת חייבת להיבדק להרג מוצלח, צלחת אח...

Caenorhabditis elegans הוצע במקור כאורגניזם מודל בשנת 19651 ומאז אומץ באופן נרחב במחקרים על גנטיקה, התפתחות, התנהגות, הזדקנות ומטבוליזם2. בשל גודלם הגדול והציפורן השקופה שלהם, C. elegans מתאים במיוחד לסינון בתפוקה גבוהה עם כתבי פלורסנט3. מחזור החיים הקצר שלהם, הרבייה ההרמפרודיטית וההומולוגיה הגנטית שלהם עם בני אדם הופכים גם את C. elegans למערכת מודל רבת ערך למחקרים על התפתחות4 וביולוגיה של הזדקנות5. יתר על כן, C. elegans הם יחסית קל לתחזוקה. ניתן לגדל תולעים בתרבית נוזלית או על צלחות אגר מוצקות ולצרוך תזונה של חיידקי Escherichia coli OP50 חיים4.
עם זאת, מקור המזון החי של C. elegans יכול לבלבל מחקרים על חילוף חומרים, תוספי תרופות והתנהגות. מאחר שלחיידקים חיים יש חילוף חומרים משלהם, תנאי ניסוי שמשפיעים על החיידקים משנים גם את חומרי המזון והמטבוליטים הזמינים לתולעים. לדוגמה, להבדלים בריכוזי חיידקי ברזל, חומצות אמינו וחומצה פולית יש השפעות מגוונות על התפתחותו, הפיזיולוגיה ותוחלת החיים של C. elegans 6. שיטות מעבדה נפוצות רבות יכולות לגרום לשינויים כאלה בהרכב החומרים המזינים ובמטבוליטים המיוצרים על ידי OP50. באופן ספציפי, חשיפה ל-5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR), תרכובת נפוצה למניעת רבייה ב-C. elegans, מעוררת שינויים נרחבים בביטוי גנים מסוג OP50, כולל מסלולי ביוסינתזה של חומצות אמינו7. חיידקים חיים יכולים גם לבלבל מחקרים שבהם C. elegans מקבלים תוספת של מולקולות קטנות מכיוון שחיידקים יכולים לעכל באופן חלקי או מלא את החומרים הפעילים. יתר על כן, ההשפעות של מולקולות קטנות אלה על החיידקים יכולות, בתורן, לשנות את הפיזיולוגיה של C. elegans, כפי שדווח עם התרופה מאריכת תוחלת החיים מטפורמין8. לבסוף, חיידקים חיים יכולים לשנות את סביבת התולעת בדרכים שמשנות התנהגות, כגון הפרשת ריחות אטרקטיביים9, ייצור נוירומודולטורים אקסוגניים10 ויצירת שיפועי חמצן במדשאת חיידקים צפופה11.
כדי למתן את ההשפעות המבלבלות של מטבוליזם חיידקי על מחקר C. elegans , פותחו שיטות רבות להרג חיידקים (טבלה 1). שלוש אסטרטגיות נפוצות לחיסול OP50 הן הקרנת UV, הרג חום וטיפול אנטיביוטי. אמנם הן פשוטות וזולות יחסית, אך לכל אחת מהשיטות הללו יכולות להיות השפעות בלתי רצויות הן על חיידקים והן על C. elegans. הריגת UV באמצעות קרוסלינקר UV12 היא תפוקה נמוכה והקצב מוגבל על ידי מספר הלוחות שיכולים להתאים לקרוסלינקר UV. יתר על כן, היעילות של הרג UV יכולה להשתנות מצלחת לצלחת בתוך אצווה, ובדיקת צמיחה על כל הצלחות יכולה להיות קשה בניסויים גדולים. OP50 הורג חום על ידי חשיפת תרבית לטמפרטורות של >60 מעלות צלזיוס מגיע עם קבוצה נפרדת של אתגרים. חום גבוה עלול לפגוע בחומרים מזינים החיוניים לתולעת ולהרוס את המבנה התאי של החיידקים, וליצור מרקם רך יותר שמקטין את משך הזמן שהתולעים מבלות במזון13. שיטה זו גם אינה יכולה לשמש לאורך מחזור החיים של C. elegans מכיוון שתולעים הניזונות מחיידקים שנהרגו בחום יכולות לעצור בשלב מוקדם בהתפתחות13. טיפול אנטיביוטי הוא שיטה נפוצה שלישית לדיכוי חילוף החומרים של חיידקים14, אך אנטיביוטיקה יכולה גם לשנות את גדילת התולעים ואת חילוף החומרים15.
פתרון אחד לסילוק ההשפעות המטבוליות של חיידקים חיים תוך שמירה על מבנה החיידקים וחומרי המזון החיוניים הוא להרוג OP50 באמצעות פרפורמלדהיד (PFA)16. PFA הוא פולימר של פורמלדהיד שיכול להצליב חלבונים בתוך תאים17 כדי למנוע שכפול חיידקים מבלי להרוס מבני תאים פנימיים כמו קרום הפלזמה הפנימי18. בשל שימור זה של המבנה התאי הפנימי, חיידקים שטופלו ב-PFA אינם מפגינים גדילה או פעילות מטבולית, אך נשארים מקור מזון אכיל ועשיר בחומרים מזינים עבור C. elegans16. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק אשר מראה כיצד להשבית מטבולית חיידקים באמצעות paraformaldehyde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שיטת</td>
			<td>חומרים נדרשים</td>
			<td colspan="2">מדרגי?</td>
			<td>תזונתי?</td>
			<td colspan="4">השפעות על תולעת?</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">UV-crosslinker</td>
			<td colspan="2">מוגבל על ידי:</td>
			<td rowspan="4">כן</td>
			<td colspan="4">השפעות משתנות על תוחלת החיים של NGM12, 23, 24</td>
		</tr><tr><td colspan="2">מספר צלחות שמתאימות לקרוסלינקר UV</td>
			<td colspan="4">השפעות משתנות על תוחלת החיים ב-FUdR24, 26, 27</td>
		</tr><tr><td colspan="2">זמן הקרנה לצלחת</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">ירידה בהעדפת מזון16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">יכולת לבדוק כל צלחת לצמיחה8</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">חום</td>
			<td rowspan="3">אינקובטור >60 מעלות צלזיוס</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">כן</td>
			<td rowspan="3">לא: הורס את דופן התא, יורד בערך התזונתי</td>
			<td colspan="4">מעצר התפתחותי 13</td>
		</tr><tr><td colspan="4">ירידה בהעדפת מזון13</td>
		</tr><tr><td colspan="4">מאריך את תוחלת החיים של NGM31</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">אנטיביוטיקה</td>
			<td rowspan="3">אנטיביוטיקה (קנמיצין, קרבניצלין וכו ')</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">כן</td>
			<td rowspan="3">כן</td>
			<td colspan="4">מעכב צמיחה והתפתחות15</td>
		</tr><tr><td colspan="4">מאריך את תוחלת החיים במדיה נוזלית19</td>
		</tr><tr><td colspan="4">מאריך את תוחלת החיים של NGM15</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">פיפ"א</td>
			<td rowspan="3">0.5% פרפורמאלדהיד</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">כן</td>
			<td rowspan="3">כן</td>
			<td colspan="4">הקטנת גודל ברוד קטן16</td>
		</tr><tr><td colspan="4">הגדלת זמן פיתוח קטנה16</td>
		</tr><tr><td colspan="4">ירידה בהעדפת מזון16</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1. השוואות של שיטות להרוג OP50. להרג קרינת UV, קוטל חום, טיפול אנטיביוטי וטיפול ב-PFA יש השפעות מגוונות על המצב התזונתי של החיידקים ועל בריאותם של תולעים הניזונות מחיידקים מטופלים. שיטות אלה להשבתה משכפלת של E. coli נבדלות גם בחומרים הנדרשים שלהן ובמדרגיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2549291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470121-700&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Density Meter</td>
			<td>Denville</td>
			<td>80-3000-45&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorg</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>975050411384RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conincal tubes (50 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmyer flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>250 mL: FB501250 
			500 mL: FB501500 
			1000 mL: FB5011000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1425500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid waste collection bottle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1230G50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (32%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Paraformaldehyde &#8211; methanol free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Easypet 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dishes (100 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>101085-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (50 mL)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11 676 083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid waste collection bucket</td>
			<td>M&#38;M Industries</td>
			<td>&#160;5.0 Gallon M1 Traditional Pail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11676331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>C Goldenwall</td>
			<td>HZ10K6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-255</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology to metabolically inactivate bacteria for caenorhabditis elegans research

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל נפוץ למחקר בגנטיקה, התפתחות, הזדקנות, מטבוליזם והתנהגות. מכיוון ש-C. elegans צורכים תזונה של חיידקים חיים, הפעילות המטבולית של מקור המזון שלהם יכולה לבלבל ניסויים המחפשים את ההשפעות הישירות של התערבויות שונות על התולעת. כדי להימנע מההשפעות המבלבלות של חילוף החומרים של חיידקים, חוקרי C. elegans השתמשו בשיטות רבות כדי להשבית חיידקים מבחינה מטבולית, כולל קרינה אולטרה סגולה (UV), הרג חום ואנטיביוטיקה. טיפול UV הוא בעל תפוקה נמוכה יחסית ולא ניתן להשתמש בו בתרבית נוזלית מכיוון שיש לבדוק כל צלחת להרג חיידקים מוצלח. שיטת טיפול שנייה, קוטלת חום, משפיעה לרעה על המרקם והאיכות התזונתית של החיידק, מה שמוביל למעצר התפתחותי של C. elegans. לבסוף, טיפול אנטיביוטי יכול לשנות ישירות את הפיזיולוגיה של C. elegans בנוסף למניעת צמיחת חיידקים. כתב יד זה מתאר שיטה חלופית לנטרול מטבולי של חיידקים באמצעות פרפורמלדהיד (PFA). טיפול PFA מצליב חלבונים בתוך תאי חיידקים כדי למנוע פעילות מטבולית תוך שמירה על מבנה התא ותכולת התזונה. שיטה זו היא בעלת תפוקה גבוהה וניתן להשתמש בה בתרבית נוזלית או בצלחות מוצקות, שכן בדיקת צלחת אחת של חיידקים שטופלו ב- PFA לגדילה מאמתת את כל האצווה. ניתן להשתמש בהשבתה מטבולית באמצעות טיפול PFA כדי לחסל את ההשפעות המבלבלות של מטבוליזם חיידקי על מחקרים של תוספי תרופות או מטבוליטים, עמידות ללחץ, מטבוליזם והתנהגות ב- C. elegans.

Caenorhabditis elegans was originally proposed as a model organism in 19651 and has since been widely adopted in studies of genetics, development, behavior, aging, and metabolism2. Due to their large brood size and transparent cuticle, C. elegans is particularly well-suited for high-throughput screening with fluorescent reporters3. Their short life cycle, hermaphroditic reproduction, and genetic homology with humans also make C. elegans a valuable model system for studies on development4 and aging biology5. Moreover, C. elegans are relatively easy to maintain. Worms can be grown in liquid culture or on solid agar plates and consume a diet of live Escherichia coli OP50 bacteria4.
However, the live food source of C. elegans can confound studies of metabolism, drug supplementation, and behavior. Because live bacteria have their own metabolism, experimental conditions that affect the bacteria also alter the nutrients and metabolites available to the worms. For example, differences in bacterial iron, amino acid, and folate concentrations have diverse effects on C. elegans&#39; development, physiology, and lifespan6. Many common lab practices can elicit such changes in the nutrient composition and metabolites produced by OP50. Specifically, exposure to 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUdR), a compound commonly used to prevent reproduction in C. elegans, elicits broad changes in OP50 gene expression, including amino acid biosynthesis pathways7. Live bacteria can also confound studies in which C. elegans are supplemented with small molecules because bacteria can partially or completely metabolize the active compounds. Moreover, the effects of these small molecules on the bacteria can, in turn, alter C. elegans physiology, as was reported with the lifespan-extending drug metformin8. Finally, live bacteria can change the worm&#39;s environment in ways that alter behavior, such as secreting attractive odorants9, producing exogenous neuromodulators10, and creating oxygen gradients in a dense bacteria lawn11.
To mitigate the confounding effects of bacterial metabolism on C. elegans research, multiple methods for killing bacteria have been developed (Table 1). Three common strategies for killing OP50 are UV-irradiation, heat-killing, and antibiotic treatment. While straightforward and relatively low-cost, each of these methods can have undesirable effects on both bacteria and C. elegans. UV-killing via a UV crosslinker12 is low-throughput and the rate is limited by the number of plates that can fit in the UV crosslinker. Moreover, the efficacy of UV-killing can vary from plate to plate within a batch, and testing for growth on all plates can become difficult in large experiments. Heat-killing OP50 by exposing culture to temperatures of &#62;60 &#176;C comes with a separate set of challenges. High heat can damage nutrients essential for the worm and destroy the cellular structure of bacteria, creating a softer texture that decreases the amount of time worms spend on the food13. This method also cannot be used throughout the life cycle of C. elegans because worms fed heat-killed bacteria can arrest early in development13. Antibiotic treatment is a third common method for suppressing bacterial metabolism14, but antibiotics can also alter worm growth and metabolism15.
One solution to eliminate the metabolic effects of live bacteria while preserving bacterial structure and essential nutrients is to kill OP50 with paraformaldehyde (PFA)16. PFA is a polymer of formaldehyde that can crosslink proteins within cells17 to prevent bacterial replication without destroying internal cell structures like the inner plasma membrane18. Due to this preservation of internal cellular structure, PFA-treated bacteria exhibit no growth or metabolic activity but remain an edible and nutrient-rich food source for C. elegans16. Here, a detailed protocol is provided which shows how to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Method</td>
			<td>Required Materials</td>
			<td colspan="2">Scalable?</td>
			<td>Nutritional?</td>
			<td colspan="4">Effects on Worm?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">UV-crosslinker</td>
			<td colspan="2">Limited by:</td>
			<td rowspan="4">Yes</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on NGM12, 23, 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Number of plates that fit in UV-crosslinker</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on FUdR24, 26, 27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Irradiation time per plate</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">Decreased food preference16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ability to check every plate for growth8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heat</td>
			<td rowspan="3">&#62;60 &#176;C incubator</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">No: destroys cell wall, decreased nutritional value</td>
			<td colspan="4">Developmental arrest 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Antibiotics</td>
			<td rowspan="3">Antibiotics (kanamycin, carbenicillin, etc.)</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Delays growth and development15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan in liquid media19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">PFA</td>
			<td rowspan="3">0.5% Paraformaldehyde</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Small brood size decrease16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Small development time increase16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference16</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Comparisons of methods to kill OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotic-treatment, and PFA-treatment have varied effects on the nutritional status of the bacteria and the health of worms fed treated bacteria. These methods for replicatively inactivating E. coli also differ in their required materials and scalability.

מחבר זרקור: קידום מחקר Caenorhabditis elegans באמצעות חיידקים שטופלו בפרפורמאלדהיד 

מתודולוגיה להשבתה מטבולית של חיידקים למחקר Caenorhabditis elegans

A challenge in sea elegance research is isolating the effects of a live bacterial diet from the effects of experimental manipulations. It can be difficult to determine whether the manipulation directly impacts the host or indirectly impacts the worms through a host microbiome interactions. Paraformaldehyde treated bacteria address the challenge of isolating the effects of bacterial metabolism from host physiology.Paraformaldehyde treatment is high throughput and consistently renders the bacteria replicate and metabolically inactive. In addition to its consistency PFA treated bacteria remain a palatable and nutritious food source.

זרימת עבודה מפורטת של הפרוטוקול מוצגת באיור 1. שיטה בעלת תפוקה גבוהה פותחה ועברה אופטימיזציה כדי להשבית באופן עקבי שכפול חיידקים (איור 2A) ומטבוליזם (איור 2B) עבור מחקרים מטבוליים ותרופתיים במחקר C. elegans באמצעות פרפורמלדהיד16. ...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Caenorhabditis elegans Research Using Paraformaldehyde-Treated Bacteria at JoVE.com

מקור המזון של Caenorhabditis elegans במעבדה הוא Escherichia coli חי. מכיוון שחיידקים פעילים מטבולית, הם מציגים משתנה מבלבל במחקרים מטבוליים ותרופתיים ב- C. elegans. כאן מתואר פרוטוקול מפורט לנטרול מטבולי של חיידקים באמצעות פרפורמלדהיד.

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a ...

אתגר במחקר האלגנטיות הימית הוא בידוד ההשפעות של תזונה חיידקית חיה מההשפעות של מניפולציות ניסיוניות. לפעמים קשה לקבוע אם המניפולציה משפיעה ישירות על הפונדקאי או בעקיפין על התולעים באמצעות אינטראקציות מיקרוביום של המארח. חיידקים המטופלים בפרפורמאלדהיד מתמודדים עם האתגר של בידוד ההשפעות של חילוף החומרים החיידקי מהפיזיולוגיה של המאכסן.הטיפול בפרפורמלדהיד הוא בעל תפוקה גבוהה וגורם באופן עקבי לחיידקים להשתכפל ולהפוך אותם ללא פעילים מטבולית. בנוסף לעקביות, חיידקים שטופלו ב-PFA נשארים מקור מזון טעים ומזין.

methodology-to-metabolically-inactivate-bacteria-for-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research

1.9K Views.  University of Michigan, Ann Arbor. אתגר במחקר האלגנטיות הימית הוא בידוד ההשפעות של תזונה חיידקית חיה מההשפעות של מניפולציות ניסיוניות. לפעמים קשה לקבוע אם המניפולציה משפיעה ישירות על הפונדקאי או בעקיפין על התולעים באמצעות אינטראקציות מיקרוביום של המארח. חיידקים המטופלים בפרפורמאלדהיד מתמודדים עם האתגר ש...

Video: מחבר זרקור: קידום מחקר Caenorhabditis elegans באמצעות חיידקים שטופלו בפרפורמאלדהיד 

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a diet of live bacteria, the metabolic activity of their food source can confound experiments looking for the direct effects of various interventions on the worm. To avoid the confounding effects of bacterial metabolism, C. elegans researchers have used multiple methods to metabolically inactivate bacteria, including ultraviolet (UV)-irradiation, heat-killing, and antibiotics. UV treatment is relatively low-throughput and cannot be used in liquid culture because each plate must be examined for successful bacterial killing. A second treatment method, heat-killing, negatively affects the texture and nutritional quality of the bacteria, leading to the developmental arrest of C. elegans. Finally, antibiotic treatment can directly alter C. elegans physiology in addition to preventing bacterial growth. This manuscript describes an alternative method to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde (PFA). PFA treatment cross-links proteins within bacterial cells to prevent metabolic activity while preserving cellular structure and nutritional content. This method is high-throughput and can be used in liquid culture or solid plates, as testing one plate of PFA-treated bacteria for growth validates the whole batch. Metabolic inactivation through PFA treatment can be used to eliminate the confounding effects of bacterial metabolism on studies of drug or metabolite supplementation, stress resistance, metabolomics, and behavior in C. elegans.

The food source for Caenorhabditis elegans in the lab is live Escherichia coli. Since bacteria are metabolically active, they present a confounding variable in metabolic and drug studies in C. elegans. A detailed protocol to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde is described here.

Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for Caenorhabditis elegans Research

Bacterial Inoculation and Paraformaldehyde Inactivation for  Caenorhabditis elegans  Research  

Begin by inoculating a single bacterial colony into 200 milliliters of sterilized Luria broth in a 500-milliliter Erlenmeyer flask. Culture the bacteria overnight in a shaker incubator set at 37 degrees. After 14 hours of culture, check the optical density of the bacteria at 600 nanometers.Aliquot the bacteria into 50-milliliter conical tubes and store them at four degrees Celsius for further use. Using a serological pipette, transfer 50 milliliters of the bacterial culture into a new 250-milliliter Erlenmeyer flask Labeled the tubes for live or mock-treated control. Use a serological pipette to transfer 50 milliliters of the bacteria to a 50-milliliter conical tube for the mock-treated control before washing.In the chemical hood, add 781 microliters of paraformaldehyde to the bacterial culture to achieve a final concentration of 0.5%Dispose of the used tip in a solid waste chemical hazard container. Next cover the flask with a sheet of foil and place it in a shaker incubator at 37 degrees Celsius for one hour. Once incubation is complete, wash the bacteria to remove any residual paraformaldehyde.For the removal of the residual paraformaldehyde, using a serological pipette, transfer the treated bacteria from the Erlenmeyer flask to a 50-milliliter conical tube. Next centrifuge the treated bacteria at approximately 3000 G for 20 minutes. Discard the supernatant into a liquid waste chemical hazard container inside the chemical hood.Now add 25 milliliters of the Luria broth to the treated and control bacterial pellets, and vortex to resuspend the bacterial pellets. Repeat the centrifugation and pellet resuspension four times. In preparation for various assays, resuspend the pellet in suitable volumes.For lifespan assays. Seed 200 microliters of bacteria resuspended in 10 milliliters of Luria broth onto 60-millimeter plates. Store the bacteria at four degrees Celsius.To perform a quality check of the bacterial growth, streak a Luria broth plate with a prepared bacteria using a sterile pipette tip. To verify contamination, steak the Luria broth used for washing and resuspending on a separate plate. Next place the plates in a 37 degrees Celsius incubator overnight.The next day, check for any bacterial growth. Save the bacteria if paraform aldehyde preparation is successful and colonies fail to grow on the LB plate. To check the bacterial metabolic activity with a respirometer, first hydrate the cartridge by adding 200 microliters of calibrant to all wells on a 96-well plate.Place the cartridge in the 96-well plate and incubate overnight at 37 degrees Celsius. Set the machine to mix, weight, measure, and loop. The next day, place the hydrated cartridge into the machine.To a new 96-well plate, add 160 microliters of M9 to the test wells, followed by 40 microliters of prepped bacteria. Add 200 microliters of M9 into the four corner wells to act as blanks. Dispense 160 microliters of M9 and 40 microliters of Luria broth as negative controls.Finally, pipette 200 microliters of M9 into the remaining unused wells. Then replace the ejected calibration plate with the assay plate before running the program. The results will be displayed as the oxygen consumption rate.Different strains exhibited different inactivation response times to paraformaldehyde. For example, exposure of HB101 bacteria to 0.25%for one hour is sufficient to render it metabolically inactive. Enterococcus faecalis required a 1.0%concentration for consistent effect.Caenorhabditis elegans worms exhibited similar preferences toward the treated OP 50 strains as well as the mock-treated control. However, a sensitive pairwise assay revealed a stronger preference for the mock-treated control. Worms on treated OP 50 have a higher pumping rate than worms on the mock-treated control.Consumption of treated bacteria resulted in delayed development time in wild-type worms, as well as lowered egg laying capacity. The lifespan of the worms was not significantly different from each other, regardless of the food source. However, the paraformaldehyde-treated bacteria increased the worm lifespan in the presence of 5-Fluoro-2'deoxyuridine Consumption of the paraformaldehyde-treated bacteria by a long-lived worm strain did not alter its longevity.