Este trabalho foi financiado pelo NIH R21AG059117 e pelo Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research da Universidade de Michigan. O SB foi financiado pela T32AG000114. O ESK foi financiado pela NSF DGE 1841052.

1. Inoculação de bactérias
<ol><li>Preparar o caldo Luria (LB) dissolvendo 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio (NaCl) em 950 mL de água destilada.</li>
	<li>Ajustar o pH do LB para 7,0 adicionando hidróxido de sódio (NaOH) 5M. Isso deve exigir apenas cerca de 0,2 mL de NaOH.</li>
	<li>Autoclave o meio LB ajustado ao pH em um ciclo líquido por 45 min a 15 psi. Deixe a solução arrefecer e armazenar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Inocular uma única colônia de bactérias em 100 mL de LB em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL. Cultivar as bactérias durante a noite em uma incubadora de agitação a 37 °C.</li>
	<li>Dependendo da saúde da colônia bacteriana, do tamanho do frasco e da velocidade com que o agitador está configurado, o tempo que leva para a bactéria crescer pode variar. Após ~14 h, verifique a densidade óptica (OD) das bactérias a 600 nm (OD600).</li>
	<li>Remova as bactérias do agitador quando o OD600 for 3,0 (1 x 109 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL). Se o OD600 for inferior a 3,0, devolva o balão à incubadora do agitador até que o OD desejado seja atingido.</li>
	<li>Aliquot as bactérias em tubos cônicos de 50 mL e armazenar a 4 °C ou prosseguir para a próxima etapa.</li>
</ol>2. Trabalhando com paraformaldeído
NOTA: A concentração de paraformaldeído (PFA) utilizada e a duração da exposição podem variar um pouco dependendo do clima, localização e tipo de bactéria a ser tratada. Um bom ponto de partida para OP50 é a exposição a PFA 0,5% por 1 h, enquanto PFA 0,25% por 1 h pode ser suficiente para HT115.
<ol><li>Prepare 32% de estoque de PFA ou use solução de PFA de 32% comprada comercialmente. Use equipamentos de proteção individual (EPIs) adequados ao trabalhar com PFA. Use luvas e proteção ocular.</li>
	<li>Adicione PFA dentro de um exaustor de fumaça química com ventilação adequada. Descarte as lavagens e pontas de PFA contendo em recipientes apropriados para riscos químicos no exaustor.</li>
</ol>3. Tratamento bacteriano com paraformaldeído
<ol><li>Quando as bactérias atingirem um OD600 de 3,0, utilizar uma pipeta sorológica para transferir 50 mL para um novo frasco de Erlenmeyer de 250 mL. Guarde o resto para um controle ao vivo, um controle simulado (consulte a etapa 4) ou para tratar também com PFA, conforme necessário.</li>
	<li>Evite derramar de um frasco para outro e tenha cuidado para não salpicar as laterais do novo frasco com bactérias. As colónias do lado do frasco podem receber uma dose mais baixa de PFA.</li>
	<li>Na capa química, adicionar 781 μL de PFA 32% a 50 mL de bactérias para elevar a concentração final a 0,5%. Descarte a ponta utilizada em recipiente para resíduos sólidos de risco químico.</li>
	<li>Cobrir o balão com papel alumínio e regressar à incubadora de agitação a 37 °C durante 1 h. Após 1 h, retirar o balão da incubadora e prosseguir para o passo 5.</li>
</ol>4. Controle simulado
<ol><li>Quando as bactérias atingirem um OD600 de 3,0, use uma pipeta sorológica para transferir 50 mL da bactéria para um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Prossiga para o passo 5.3 para concluir os passos de lavagem semelhantes ao grupo tratado com PFA.</li>
</ol>5. Lavar as bactérias para remover PFA residual
<ol><li>Na capa química, utilizar uma pipeta sorológica para transferir as bactérias tratadas do frasco de Erlenmeyer para um tubo cônico de 50 mL. O uso de uma pipeta sorológica em vez de derramar as bactérias evitará a contaminação de quaisquer colônias bacterianas na borda do frasco que possam ter evitado o tratamento direto com PFA.</li>
	<li>Centrifuga tratou bactérias a aproximadamente 3000 x g por 20 min. Remova o sobrenadante descartando-o em um recipiente de risco químico de resíduos líquidos na coifa química.</li>
	<li>Adicione 25 mL de LB e vórtice para ressuspender o pellet bacteriano (Encher o tubo totalmente dificulta a ressuspensão do pellet). Repita a centrifugação e a ressuspensão do pellet 4x.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet em volumes ideais para diferentes ensaios. Para os ensaios de vida útil, sementes de placas de 60 mm com 200 μL de bactérias ressuspendidas em 10 mL de LB. A ressuspensão das bactérias em 10 mL de LB resulta em uma concentração de 5x da cultura original de 50 mL.</li>
	<li>Conservar as bactérias a 4 °C.</li>
</ol>6. Verificação da qualidade do crescimento bacteriano
<ol><li>Após a lavagem final e ressuspensão, passe uma placa LB (usando uma ponta de pipeta estéril) com as bactérias preparadas. É uma boa prática riscar o LB usado para lavar e ressuspender em uma placa separada, bem como certificar-se de que o LB usado não foi contaminado.</li>
	<li>Coloque as placas em uma incubadora de 37 °C durante a noite. Verifique se há algum crescimento. As bactérias são consideradas replicativamente mortas quando as colônias não crescem na placa LB.</li>
</ol>7. Verificação de qualidade do metabolismo bacteriano usando um respirômetro
<ol><li>Após a lavagem final e ressuspensão do passo 5.4, confirmar se as bactérias estão metabolicamente mortas usando ferramentas disponíveis, como respirômetros19,20 e medindo a taxa basal de consumo de oxigênio (OCR).</li>
	<li>Preparar solução M9: Dissolver 3 g de fosfato de potássio monobásico (KH 2 PO 4), 6 g de fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) e 5 g de cloreto de sódio (NaCl) em 950 ml de água destilada. Autoclave em ciclo líquido por 45 min a 15 psi e, em seguida, deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente. Adicionar 1 mL de sulfato de magnésio 1 M (MgSO4) e armazenar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Hidratar o cartucho do respirômetro: Adicione 200 μL de calibrador a todos os poços de uma placa de 96 poços. Coloque o cartucho na placa de 96 poços e incube durante a noite em uma incubadora de 37 °C.</li>
	<li>Calibração do ensaio: No dia seguinte, coloque o cartucho hidratado na máquina e inicie a calibração.</li>
	<li>Configuração da placa de teste de ensaio: Usando uma nova placa de 96 poços, adicione 160 μL de M9 e 40 μL das bactérias preparadas (1 x 109 UFC/mL) para testar poços. Adicione 200 μL de M9 aos 4 poços de canto para usar como poços em branco. Adicionar 160 μL de M9 e 40 μL de LB utilizados para lavagem e ressuspensão para utilização como controlos negativos. Adicionar 200 μL de M9 ao restante dos poços que não serão utilizados.</li>
	<li>Execute o ensaio: Quando a calibração do cartucho estiver concluída, insira a placa de ensaio da etapa 7.5 na máquina para análise. As configurações incluem etapas para misturar, esperar, medir e fazer loop. Os resultados serão apresentados como taxa de consumo de oxigênio (OCR). As bactérias estão metabolicamente mortas e prontas para uso quando o OCR é zero.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65775/65775fig01.jpg"> Gráfico 1. Fluxo de trabalho para tratamento com paraformaldeído. Uma única colônia de bactérias E. coli OP50 é cultivada durante a noite. PFA é adicionado a uma concentração final de 0,5%, e a cultura tratada com PFA é agitada por 1 h a 37 °C. Finalmente, o PFA é removido lavando a cultura com LB fresco 5x. Para confirmar que as bactérias tratadas são replicativamente inativas, retire uma placa LB das bactérias tratadas e cresça durante a noite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65775/65775fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Inativação Metabólica Bacteriana em Caenorhabditis elegans Usando Paraformaldeído

<ol>
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C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour.">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li><li>Stuhr, N. L., Curran, S. 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Os autores não têm nada a revelar.

Benefícios da morte por PFA em relação a outros métodos de eliminação bacteriana O tratamento com PFA é um método de alto rendimento para prevenir o metabolismo bacteriano, mantendo uma fonte de alimento nutritivo para C. elegans. Matar bactérias através do tratamento com PFA tem múltiplas vantagens sobre outros métodos. Ao contrário do tratamento UV, onde cada placa deve ser testada para matar com sucesso, uma única placa de um lote de bactérias tratadas com PFA pode ser testa...

Caenorhabditis elegans foi originalmente proposto como organismo modelo em 19651 e desde então tem sido amplamente adotado em estudos de genética, desenvolvimento, comportamento, envelhecimento e metabolismo2. Devido ao seu grande tamanho de ninhada e cutícula transparente, C. elegans é particularmente adequada para triagem de alto rendimento com repórteres fluorescentes3. Seu curto ciclo de vida, reprodução hermafrodita e homologia genética com humanos também fazem de C. elegans um valioso sistema modelo para estudos sobre o desenvolvimento4 e biologia do envelhecimento5. Além disso, C. elegans são relativamente fáceis de manter. Os vermes podem ser cultivados em cultura líquida ou em placas sólidas de ágar e consumir uma dieta de bactérias vivas de Escherichia coli OP504.
No entanto, a fonte de alimento vivo de C. elegans pode confundir estudos de metabolismo, suplementação de drogas e comportamento. Como as bactérias vivas têm seu próprio metabolismo, as condições experimentais que afetam as bactérias também alteram os nutrientes e metabólitos disponíveis para os vermes. Por exemplo, diferenças nas concentrações bacterianas de ferro, aminoácidos e folato têm diversos efeitos sobre o desenvolvimento, fisiologia e vida útil de C. elegans 6. Muitas práticas comuns de laboratório podem provocar tais mudanças na composição de nutrientes e metabólitos produzidos pelo OP50. Especificamente, a exposição à 5-fluor-2'-desoxiuridina (FUdR), um composto comumente usado para prevenir a reprodução em C. elegans, provoca amplas alterações na expressão gênica do gene OP50, incluindo vias de biossíntese de aminoácidos7. Bactérias vivas também podem confundir estudos em que C. elegans são suplementados com pequenas moléculas porque as bactérias podem metabolizar parcial ou completamente os compostos ativos. Além disso, os efeitos dessas pequenas moléculas sobre as bactérias podem, por sua vez, alterar a fisiologia de C. elegans, como foi relatado com o fármaco que prolonga a vida útil da metformina8. Finalmente, bactérias vivas podem alterar o ambiente do verme de maneiras que alteram o comportamento, como secretar odorantes atraentes9, produzir neuromoduladores exógenos10 e criar gradientes de oxigênio em um gramado bacteriano denso11.
Para atenuar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano na pesquisa de C. elegans , vários métodos para matar bactérias foram desenvolvidos (Tabela 1). Três estratégias comuns para matar OP50 são irradiação UV, morte por calor e tratamento com antibióticos. Embora simples e relativamente de baixo custo, cada um desses métodos pode ter efeitos indesejáveis sobre bactérias e C. elegans. A eliminação por UV através de um reticulador UV12 é de baixo rendimento e a taxa é limitada pelo número de placas que podem caber no reticulante UV. Além disso, a eficácia da eliminação por UV pode variar de placa para placa dentro de um lote, e o teste de crescimento em todas as placas pode se tornar difícil em grandes experimentos. Matar o calor OP50 expondo a cultura a temperaturas de >60 °C vem com um conjunto separado de desafios. O calor elevado pode danificar nutrientes essenciais para o verme e destruir a estrutura celular das bactérias, criando uma textura mais macia que diminui a quantidade de tempo que os vermes passam no alimento13. Este método também não pode ser usado durante todo o ciclo de vida de C. elegans , pois vermes alimentados com bactérias mortas pelo calor podem parar no início do desenvolvimento13. O tratamento com antibióticos é um terceiro método comum para suprimir o metabolismo bacteriano14, mas os antibióticos também podem alterar o crescimento e o metabolismo do verme15.
Uma solução para eliminar os efeitos metabólicos de bactérias vivas, preservando a estrutura bacteriana e nutrientes essenciais, é matar a OP50 com paraformaldeído (PFA)16. O PFA é um polímero de formaldeído que pode fazer ligações cruzadas entre proteínas dentro das células17 para impedir a replicação bacteriana sem destruir estruturas celulares internas, como a membrana plasmática interna18. Devido a essa preservação da estrutura celular interna, as bactérias tratadas com PFA não exibem crescimento ou atividade metabólica, mas permanecem como fonte alimentar comestível e rica em nutrientes para C. elegans16. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido que mostra como inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Método</td>
			<td>Materiais necessários</td>
			<td colspan="2">Escalonável?</td>
			<td>Nutricional?</td>
			<td colspan="4">Efeitos sobre o verme?</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">Reticulante UV</td>
			<td colspan="2">Limitado por:</td>
			<td rowspan="4">Sim</td>
			<td colspan="4">Efeitos variáveis na vida útil de NGM12, 23, 24</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Número de placas que se encaixam no reticulante UV</td>
			<td colspan="4">Efeitos variáveis na vida útil do FUdR24, 26, 27</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tempo de irradiação por placa</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">Diminuição da preferência alimentar16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Capacidade de verificar o crescimento de cada placa8</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Calor</td>
			<td rowspan="3">Incubadora >60 °C</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Sim</td>
			<td rowspan="3">Não: destrói a parede celular, diminuição do valor nutricional</td>
			<td colspan="4">Prisão preventiva 13</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Diminuição da preferência alimentar13</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Prolonga a vida útil no NGM31</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Antibióticos</td>
			<td rowspan="3">Antibióticos (canamicina, carbenicilina, etc.)</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Sim</td>
			<td rowspan="3">Sim</td>
			<td colspan="4">Atrasa o crescimento e o desenvolvimento15</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Prolonga a vida útil em meios líquidos19</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Prolonga a vida útil no NGM15</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">PFA</td>
			<td rowspan="3">0,5% Paraformaldeído</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Sim</td>
			<td rowspan="3">Sim</td>
			<td colspan="4">Diminuição do tamanho da ninhadapequena 16</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Aumento do tempo de desenvolvimentopequeno 16</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Diminuição da preferência alimentar16</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1. Comparações de métodos para matar OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotico-treatment, e PFA-treatment têm efeitos variados sobre o estado nutricional das bactérias e a saúde dos vermes alimentados com bactérias tratadas. Esses métodos para inativar replicativamente E. coli também diferem em seus materiais necessários e escalabilidade.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2549291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470121-700&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Density Meter</td>
			<td>Denville</td>
			<td>80-3000-45&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorg</td>
			<td>5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical fume hood</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>975050411384RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conincal tubes (50 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmyer flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>250 mL: FB501250 
			500 mL: FB501500 
			1000 mL: FB5011000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1425500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid waste collection bottle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1230G50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (32%)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Paraformaldehyde &#8211; methanol free solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Easypet 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dishes (100 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>101085-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (50 mL)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>12-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11 676 083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid waste collection bucket</td>
			<td>M&#38;M Industries</td>
			<td>&#160;5.0 Gallon M1 Traditional Pail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11676331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing balance</td>
			<td>C Goldenwall</td>
			<td>HZ10K6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-255</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology to metabolically inactivate bacteria for caenorhabditis elegans research

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo comum para pesquisa em genética, desenvolvimento, envelhecimento, metabolismo e comportamento. Como C. elegans consomem uma dieta de bactérias vivas, a atividade metabólica de sua fonte alimentar pode confundir experimentos que procuram os efeitos diretos de várias intervenções sobre o verme. Para evitar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano, os pesquisadores de C. elegans usaram vários métodos para inativar metabolicamente as bactérias, incluindo irradiação ultravioleta (UV), morte por calor e antibióticos. O tratamento UV é relativamente baixo rendimento e não pode ser usado em cultura líquida porque cada placa deve ser examinada para matar bactérias com sucesso. Um segundo método de tratamento, o termo-matança, afeta negativamente a textura e a qualidade nutricional das bactérias, levando à parada do desenvolvimento de C. elegans. Finalmente, o tratamento com antibióticos pode alterar diretamente a fisiologia de C. elegans , além de prevenir o crescimento bacteriano. Este manuscrito descreve um método alternativo para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído (PFA). O tratamento com PFA faz ligações cruzadas de proteínas dentro das células bacterianas para prevenir a atividade metabólica, preservando a estrutura celular e o conteúdo nutricional. Este método é de alto rendimento e pode ser usado em cultura líquida ou placas sólidas, pois o teste de uma placa de bactérias tratadas com PFA para crescimento valida todo o lote. A inativação metabólica através do tratamento com PFA pode ser usada para eliminar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano em estudos de suplementação de drogas ou metabólitos, resistência ao estresse, metabolômica e comportamento em C. elegans.

Caenorhabditis elegans was originally proposed as a model organism in 19651 and has since been widely adopted in studies of genetics, development, behavior, aging, and metabolism2. Due to their large brood size and transparent cuticle, C. elegans is particularly well-suited for high-throughput screening with fluorescent reporters3. Their short life cycle, hermaphroditic reproduction, and genetic homology with humans also make C. elegans a valuable model system for studies on development4 and aging biology5. Moreover, C. elegans are relatively easy to maintain. Worms can be grown in liquid culture or on solid agar plates and consume a diet of live Escherichia coli OP50 bacteria4.
However, the live food source of C. elegans can confound studies of metabolism, drug supplementation, and behavior. Because live bacteria have their own metabolism, experimental conditions that affect the bacteria also alter the nutrients and metabolites available to the worms. For example, differences in bacterial iron, amino acid, and folate concentrations have diverse effects on C. elegans&#39; development, physiology, and lifespan6. Many common lab practices can elicit such changes in the nutrient composition and metabolites produced by OP50. Specifically, exposure to 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUdR), a compound commonly used to prevent reproduction in C. elegans, elicits broad changes in OP50 gene expression, including amino acid biosynthesis pathways7. Live bacteria can also confound studies in which C. elegans are supplemented with small molecules because bacteria can partially or completely metabolize the active compounds. Moreover, the effects of these small molecules on the bacteria can, in turn, alter C. elegans physiology, as was reported with the lifespan-extending drug metformin8. Finally, live bacteria can change the worm&#39;s environment in ways that alter behavior, such as secreting attractive odorants9, producing exogenous neuromodulators10, and creating oxygen gradients in a dense bacteria lawn11.
To mitigate the confounding effects of bacterial metabolism on C. elegans research, multiple methods for killing bacteria have been developed (Table 1). Three common strategies for killing OP50 are UV-irradiation, heat-killing, and antibiotic treatment. While straightforward and relatively low-cost, each of these methods can have undesirable effects on both bacteria and C. elegans. UV-killing via a UV crosslinker12 is low-throughput and the rate is limited by the number of plates that can fit in the UV crosslinker. Moreover, the efficacy of UV-killing can vary from plate to plate within a batch, and testing for growth on all plates can become difficult in large experiments. Heat-killing OP50 by exposing culture to temperatures of &#62;60 &#176;C comes with a separate set of challenges. High heat can damage nutrients essential for the worm and destroy the cellular structure of bacteria, creating a softer texture that decreases the amount of time worms spend on the food13. This method also cannot be used throughout the life cycle of C. elegans because worms fed heat-killed bacteria can arrest early in development13. Antibiotic treatment is a third common method for suppressing bacterial metabolism14, but antibiotics can also alter worm growth and metabolism15.
One solution to eliminate the metabolic effects of live bacteria while preserving bacterial structure and essential nutrients is to kill OP50 with paraformaldehyde (PFA)16. PFA is a polymer of formaldehyde that can crosslink proteins within cells17 to prevent bacterial replication without destroying internal cell structures like the inner plasma membrane18. Due to this preservation of internal cellular structure, PFA-treated bacteria exhibit no growth or metabolic activity but remain an edible and nutrient-rich food source for C. elegans16. Here, a detailed protocol is provided which shows how to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Method</td>
			<td>Required Materials</td>
			<td colspan="2">Scalable?</td>
			<td>Nutritional?</td>
			<td colspan="4">Effects on Worm?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">UV</td>
			<td rowspan="4">UV-crosslinker</td>
			<td colspan="2">Limited by:</td>
			<td rowspan="4">Yes</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on NGM12, 23, 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Number of plates that fit in UV-crosslinker</td>
			<td colspan="4">Variable effects on lifespan on FUdR24, 26, 27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Irradiation time per plate</td>
			<td colspan="4" rowspan="2">Decreased food preference16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ability to check every plate for growth8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heat</td>
			<td rowspan="3">&#62;60 &#176;C incubator</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">No: destroys cell wall, decreased nutritional value</td>
			<td colspan="4">Developmental arrest 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Antibiotics</td>
			<td rowspan="3">Antibiotics (kanamycin, carbenicillin, etc.)</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Delays growth and development15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan in liquid media19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Extends lifespan on NGM15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">PFA</td>
			<td rowspan="3">0.5% Paraformaldehyde</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Yes</td>
			<td rowspan="3">Yes</td>
			<td colspan="4">Small brood size decrease16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Small development time increase16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Decreased food preference16</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Comparisons of methods to kill OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotic-treatment, and PFA-treatment have varied effects on the nutritional status of the bacteria and the health of worms fed treated bacteria. These methods for replicatively inactivating E. coli also differ in their required materials and scalability.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de Caenorhabditis elegans usando bactérias tratadas com paraformaldeído 

Metodologia para Inativação Metabolicamente de Bactérias para Pesquisa de Caenorhabditis elegans

A challenge in sea elegance research is isolating the effects of a live bacterial diet from the effects of experimental manipulations. It can be difficult to determine whether the manipulation directly impacts the host or indirectly impacts the worms through a host microbiome interactions. Paraformaldehyde treated bacteria address the challenge of isolating the effects of bacterial metabolism from host physiology.Paraformaldehyde treatment is high throughput and consistently renders the bacteria replicate and metabolically inactive. In addition to its consistency PFA treated bacteria remain a palatable and nutritious food source.

Um fluxo de trabalho detalhado do protocolo é mostrado na Figura 1. Um método de alto rendimento foi desenvolvido e otimizado para inativar consistentemente a replicação bacteriana (Figura 2A) e o metabolismo (Figura 2B) para estudos metabólicos e de drogas em pesquisas de C. elegans usando paraformaldeído16. O objetivo era determinar a menor concentração de PFA necessária e o menor tempo ne...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Caenorhabditis elegans Research Using Paraformaldehyde-Treated Bacteria at JoVE.com

A fonte de alimento para Caenorhabditis elegans no laboratório é Escherichia coli viva. Como as bactérias são metabolicamente ativas, elas apresentam uma variável de confusão em estudos metabólicos e de drogas em C. elegans. Um protocolo detalhado para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído é descrito aqui.

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a ...

Um desafio na pesquisa da elegância marinha é isolar os efeitos de uma dieta bacteriana viva dos efeitos de manipulações experimentais. Pode ser difícil determinar se a manipulação afeta diretamente o hospedeiro ou indiretamente os vermes por meio de interações com o microbioma do hospedeiro. As bactérias tratadas com paraformaldeído enfrentam o desafio de isolar os efeitos do metabolismo bacteriano da fisiologia do hospedeiro.O tratamento com paraformaldeído é de alto rendimento e consistentemente torna as bactérias replicantes e metabolicamente inativas. Além de sua consistência, as bactérias tratadas com PFA permanecem uma fonte de alimento palatável e nutritivo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research

1.9K visualizações.  University of Michigan, Ann Arbor. Um desafio na pesquisa da elegância marinha é isolar os efeitos de uma dieta bacteriana viva dos efeitos de manipulações experimentais. Pode ser difícil determinar se a manipulação afeta diretamente o hospedeiro ou indiretamente os vermes por meio de interações com o microbioma do hospedeiro. As bactérias tratadas com paraformaldeído enfrentam o desafio de isolar os efeitos do metabolismo bacteriano da fisiologia do hospedeiro.O tratamento com paraformaldeído é de alto ren...