Para comenzar, tome 500 microlitros de la solución preparada de PBS/BEV. Combínalo con tres mililitros de PBS y mezcla suavemente con una pipeta de 1.000 microlitros. Coloque un tubo de ultracentrífuga de 31 mililitros en una placa de espuma con agujeros y etiquete el tubo con una flecha hacia abajo.
A continuación, sostenga una pipeta de 1.000 microlitros verticalmente y añada tres mililitros de la solución de yodixanol al 50% en el fondo del tubo. Coloque un soporte para tubos ligeramente por encima del nivel de la placa de espuma debajo de la abertura del tubo e incline el tubo en un ángulo de 70 grados. Con una pipeta de 1.000 microlitros, agregue tres mililitros de solución de yodixanol al 40 % sobre la solución de iodixanol al 50 %.
A continuación, coloque tres mililitros de solución de yodixanol al 20% sobre la solución de yodixanol al 40%. Con una pipeta de 1.000 microlitros, añadir tres mililitros de una solución de yodixanol al 10 % encima de la solución preparada de yodixanol al 20 %. A continuación, agregue 3,5 mililitros de la solución de PBS/BEV encima de la solución de yodixanol al 10% y vuelva a colocar suavemente los tubos en posición vertical.
Ahora, coloque un tubo de ultracentrífuga de 31 mililitros en una placa de espuma con agujeros y etiquételo con una flecha hacia arriba. Con una pipeta de 1.000 microlitros, agregue verticalmente 2,5 mililitros de la solución madre de yodixanol al 60 % en el fondo del tubo y combínelo con 500 microlitros de solución de PBS/BEV para obtener tres mililitros de solución de BEV al 50 % de iodixanol. Mezcle bien la solución pipeteando.
A continuación, después de aplicar una solución de 40, 20 y 10 % de yodixanol en secuencia, utilice una pipeta de 1.000 microlitros para añadir 3,5 mililitros de PBS encima de la solución de 10 % de iodixanol. Ajuste el peso de los dos tubos con PBS a un peso total dentro de más menos 0,005 gramos. A continuación, coloque los tubos en los cubos y centrifugérelos a 160.000 G durante siete horas a cuatro grados centígrados.
Con una pipeta, recoja las fracciones obtenidas de un modo de ultracentrifugación de gradiente secuencialmente de arriba a abajo contra la pared lateral en 10 tubos de ultracentrífuga separados de 38,5 mililitros. A continuación, ultracentrifugar las fracciones a 160.000 G durante 70 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante e invierta los tubos de ultracentrífuga durante cinco minutos.
A continuación, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de PBS preenfriado con una pipeta de 200 microlitros. Transfiera la solución de PBS/BEV a un microtubo limpio de 1,5 mililitros. Etiquete las fracciones de F1 a F10 como obtenidas de un modo de ultracentrifugación de gradiente y proceda al análisis.
