Este protocolo proporciona una forma factible de aislar y recolectar las vesículas extracelulares correctas de la mayoría de los tejidos sanguíneos y sólidos, especialmente analizar su fuente y el contenido de proteínas, lo que ayuda a realizar experimentos funcionales. Además del alto rendimiento y la baja contaminación, la principal ventaja de este protocolo es el análisis de antígenos superficiales y cargas de proteínas de EV, que es útil para estudios fisiológicos y patológicos. Facilita el diagnóstico de cánceres de enfermedades, como enfermedades inflamatorias y osteoporosis mediante la detección de marcadores superficiales de células parentales de vesículas extracelulares con un citómetro de flujo.
La cantidad de vesícula extracelular tisular es crítica para los siguientes experimentos. Asegúrese de que la concentración de vesícula extracelular no sea alta. Sea paciente para realizar la dilución.
Para comenzar, prepare las muestras de hueso maxilar aislando el hueso maxilar con pinzas oftálmicas y tijeras y lávelas con PBS para deshacerse de los tejidos blandos con pinzas. Luego coloque el hueso maxilar en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros y corte el hueso en trozos pequeños de un milímetro de diámetro con tijeras. Agregue una cierta cantidad de Liberase para cubrir el tejido e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
A continuación, centrifugar la muestra a 800 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y transferir cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta a unos tubos de centrífuga nuevos y limpios de 1,5 mililitros. Después de centrifugar las muestras de plasma y hueso preparadas durante 15 minutos a 2, 500 G y cuatro grados centígrados para eliminar los restos de células grandes y las plaquetas restantes, transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a tubos de centrífuga nuevos y limpios de 1,5 mililitros y centrifugar a 16, 800 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en cada tubo con un mililitro de PBS.
Después de centrifugar y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente, nuevamente, resuspenda los pellets en cada tubo con 50 microlitros de PBS y almacene estas muestras a cuatro grados centígrados durante menos de 24 horas o preferiblemente utilícelas inmediatamente para los análisis. Resuspenda las muestras con 500 microlitros de PBS y transfiera 50 microlitros a un tubo de centrífuga nuevo y limpio de 1,5 mililitros como un control en blanco etiquetado como tubo A y otros 50 microlitros en otro tubo de centrífuga limpio de 1,5 mililitros como un tubo de tinción simple para FITC, etiquetado como tubo B.Agregue 0,5 microlitros de colorante de membrana al tubo primario para la tinción de membrana mientras incuba durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar el tubo primario durante 30 minutos a 16, 800 G y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender los gránulos con 200 microlitros de PBS.
Divida cada muestra de 50 microlitros en cuatro tubos centrífugos de 1,5 mililitros para tubos de tinción simples para PE marcados como tubo C, tinción de marcadores de superficie etiquetados como tubo D y controles secundarios de solo anticuerpos etiquetados como tubo E.Agregue el anticuerpo primario de muestras de vesículas extracelulares óseas y receptores asociados a osteoclastos, así como muestras de vesículas extracelulares de plasma y anticuerpos CD-18 al tubo B y al tubo D por separado, incubando durante una hora a cuatro grados centígrados. Centrifugar los tubos y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente y resuspender los pellets con 500 microlitros de PBS. Una vez más, centrifugar durante 30 minutos a 16, 800 G y cuatro grados centígrados para eliminar los anticuerpos primarios adicionales.
Después de desechar el sobrenadante, resuspenda los gránulos con 50 microlitros de PBS, seguido de agregar anticuerpos secundarios conjugados FITC respectivamente en el tubo E.Incubar todos los tubos durante una hora a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Diluya una gota de suspensión de perlas de 0.2, 0.5 y un micrómetro respectivamente en un mililitro de PBS. Luego ejecute cada tamaño de perlas para asegurarse de la puerta elegida para las vesículas extracelulares y establezca el umbral del citómetro de flujo para buscar las perlas y la población de vesículas extracelulares utilizando una dispersión interior hacia adelante adecuada.
Establezca la condición terminal como cálculo de 100, 000 partículas teñidas por membrana y analice la muestra a través de un citómetro de flujo como se describe en el manuscrito. Resuspender los gránulos en 50 microlitros de tampón de lisis RIPA e incubar durante 30 minutos en hielo. Para cuantificar las concentraciones de proteína de todas las muestras en la microplaca de 96 pocillos mediante el ensayo de proteína BCA, diluya los dos miligramos por mililitros de BSA con 0,9% de solución salina normal en 0,5 miligramos por mililitro.
A 0,5 miligramos por mililitro de BSA y 0,9% de solución salina normal en tres pocillos duplicados con ciertos volúmenes. Luego deje caer dos microlitros de las muestras y agregue 18 microlitros de solución salina normal en tres pocillos duplicados por separado. Después de preparar una solución de trabajo mezclando el reactivo BCA A con el reactivo B, agregue 200 microlitros de la solución de trabajo a cada pocillo y agite suavemente durante 30 segundos.
Luego incubar la microplaca de 96 pocillos durante 20 a 25 minutos a 37 grados centígrados y medir la densidad óptica a 596 nanómetros con el espectrofotómetro. A continuación, exporte los datos, dibuje una curva estándar y calcule la concentración de proteínas de las muestras. De acuerdo con los resultados, diluir las muestras a un microgramo por microlitro con 0,9% de solución salina normal y cinco veces la concentración de tampón de carga SDS-PAGE y sellar los tubos con película herméticamente y calentar durante cinco minutos a 100 grados centígrados.
Cargue las muestras en la escala de proteínas en una concentración de gradiente de cuatro a 20% de gel de tris de HEPy. Pase el gel en el tampón de funcionamiento a 80 voltios hasta que las proteínas formen una línea. Luego cambie a 120 voltios durante una hora hasta que el tinte de carga esté en el fondo del gel.
Transfiera el gel a la membrana de fluoruro de polivinilideno preincubada en alcohol metílico durante 20 segundos utilizando un sistema de transferencia húmeda para transferir durante una hora a 200 miliamperios. Prepare un tampón de bloqueo de BSA al 5% agregando 2.5 gramos de BSA y 50 mililitros de TBST en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Bloquee las membranas en este tampón durante dos horas a temperatura ambiente con agitación.
Incubar las membranas con anticuerpos primarios específicos diluidos con TBST en la concentración adecuada durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave las membranas en el tampón de lavado cuatro veces e incube las membranas con anticuerpos secundarios adecuados durante una hora a temperatura ambiente con agitación. Después de lavar las membranas en el tampón de lavado cuatro veces, obtenga una imagen de las membranas utilizando el kit de quimioluminiscencia en un sistema de imágenes de gel.
La microscopía electrónica de transmisión y el análisis de seguimiento de nanopartículas revelaron que las características morfológicas típicas de las vesículas extracelulares eran redondas y en forma de copa con un diámetro que oscilaba entre 500 y 300 nanómetros. El análisis de citometría de flujo muestra los porcentajes de marcadores de membrana específicos expresados en vesículas extracelulares que implican su origen a partir de células madre. El análisis Western blot muestra la expresión de PGD y PKM2 respectivamente como un representante del contenido de proteínas y vesículas extracelulares plasmáticas y vesículas extracelulares óseas, indicando el estado metabólico.
La expresión negativa de Golgin-84 en vesículas extracelulares se detectó con la presencia de mitofilina, alfa-actinina-4, flotillina-1, caveolina-1 y beta-actina, junto con el marcador de vesículas CD9, mientras que la expresión de CD81 es baja o ausente con una falta de existencia de APO-A-1 en las vesículas extracelulares plasmáticas. Investigadores, teniendo en cuenta que el paso 2.2, la preparación y la digestión de las muestras de tejido deben hacerse suficientemente. De lo contrario, el número de vesículas extracelulares extraídas de los tejidos es limitado.
El marcador marcado como tinción fluorescente de las vesículas extracelulares se puede inyectar en la boca para tratar la fase que se vincula a la función potencial.
