Para marcar los pericitos, agregue el tinte fluorescente TO-PRO-3 al líquido cefalorraquídeo artificial o ACSF. Ahora incube el cerebro de rata recién cortado en el ACSF cargado de colorante durante 20 minutos en un ambiente oscuro a temperatura ambiente. A continuación, transfiera el colador de malla de nailon con las rodajas de cerebro a una cámara de enjuague de seis platos.
Deje reposar las rodajas de cerebro en la cámara durante 10 minutos. Para marcar los pericitos no vitales, incube los cortes de cerebro marcados con TO-PRO-3 en isolectina B4 conjugada a 37 grados Celsius durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, enjuague las rodajas de cerebro en líquido cefalorraquídeo artificial durante 15 minutos.
A continuación, coloque las rodajas de cerebro en ACSF gaseadas con un 5% de dióxido de carbono y un 95% de oxígeno. A esto, agregue yoduro de propidio a una concentración de 37 micromolares a 37 grados Celsius. Para detener la absorción de colorante y minimizar el etiquetado de fondo, enjuague las preparaciones durante 15 minutos en ACSF.
En condiciones fisiológicas normales, los pericitos cerebrales no experimentan muerte celular. Se detectaron pericitos viables que no estaban teñidos con yoduro de propidio. Los modelos de HSA deben ser vitales para los pericitos dentro de la microvasculatura.
También se detectaron pericitos no vitales. Los pericitos no vitales marcados con yoduro de propidio permanecieron adheridos a toda la microvasculatura.
