Antes del paso de la célula. Cubra una placa de seis pocillos con una solución de recubrimiento en frío e incube a 37 grados Celsius con dióxido de carbono al 5% durante una hora, aspire el medio de células madre de la placa de seis pocillos que contiene células madre pluripotentes humanas y agregue un mililitro de DPBS sin calcio y magnesio en cada pocillo. Después del segundo lavado, agregue 500 microlitros de solución de disociación en cada pocillo e incube durante dos a cinco minutos a temperatura ambiente.
Mientras tanto, aspire la solución de recubrimiento de la placa de seis pocillos y agregue un mililitro de DPBS sin calcio y magnesio en cada pocillo. Bajo un microscopio invertido, observe el proceso de disociación celular. Cuando el 80 al 90% de las células parecían ser redondeadas y adherentes, aspirar la solución de disociación de los pocillos de la placa de seis pocillos.
A continuación, añada un mililitro de medio de células madre que contenga 10 micromolares inhibidores de roca en la placa de seis pocillos. Agregue 10 microlitros de suspensión celular disociada en un tubo. Luego, agregue un volumen igual de azul de tripano.
Mezcle suavemente y cuente las células con un hemocitómetro. Después del recuento de células, agregue dos mililitros de medio de células madre por pocillo que contenga de 0.8 a 1 veces 10 a las 6 células por mililitro y 10 micromolares inhibidor de rocas. Mueva rápidamente el plato hacia adelante y hacia atrás, de lado a lado, tres veces.
Coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Mueva rápidamente el plato hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado 10 veces antes de incubar durante dos horas. Descongele tanto el medio basal durante los días cero y cuatro como los suplementos en hielo.
Calentar dos mililitros cada día, uno mediano y lavar el medio en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, aspire el medio de células madre de los pocillos de una placa de seis pocillos y agregue dos mililitros de medio de lavado uno. Después de aspirar el medio de lavado uno, agregue inmediatamente dos mililitros del medio del primer día al costado del pozo.
Incubar las células a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante 24 horas. En el día 12 del proceso de diferenciación, trate una placa de seis pocillos que contiene micropocillos de 400 micrómetros con dos mililitros de solución de enjuague antiadherente. Bajo un microscopio invertido, observe la placa en busca de burbujas.
Si no se observan burbujas, aspirar la solución de enjuague antiadherente e inmediatamente agregar dos mililitros de medio de lavado dos. A continuación, aspire el medio progenitor pancreático y añada 0,5 mililitros de tampón de disociación por pocillo. Incuba las células a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos.
Cuando la mayoría de las celdas estén redondeadas y aún estén adheridas, aspire el tampón de disociación e inmediatamente agregue un mililitro de medio de racimo caliente a cada pocillo. Con una punta de pipeta P1000, disocie las células suavemente, pipeteando hacia arriba y hacia abajo mientras usa alternativamente un movimiento circular y se mueve de la parte superior a la inferior del pocillo para separar las celdas de manera uniforme en todo el pocillo. Transfiera la mezcla celular disociada a un tubo cónico de 50 mililitros.
Agregue un mililitro del medio del racimo en la placa de seis pocillos para recolectar todas las células restantes. A continuación, aspire el medio de lavado dos de la placa de seis pocillos de micropocillos y agregue la suspensión celular disociada. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 24 horas.
Al día siguiente, con una punta de pipeta P1000, recoja lentamente los racimos de la placa de seis pocillos de micropocillos en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue un mililitro de medio de día 13 para recolectar los racimos restantes y transfiera los racimos al tubo. Deje que las células se fijen naturalmente bajo gravedad en el fondo del tubo durante cinco minutos.
Aspire cuidadosamente el sobrenadante del tubo sin alterar los grupos celulares. A continuación, añade dos mililitros de medio día 13 en el tubo. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, evitando la aspiración de racimos.
Transfiera la suspensión a una placa de seis pocillos de muy baja adherencia. Mueva rápidamente el plato hacia adelante y hacia atrás, de lado a lado, seis veces. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 48 horas.
Las imágenes de inmunofluorescencia de los conglomerados mostraron un predominio de células productoras de insulina que coexpresan los marcadores de células beta pancreáticas. La expresión de los genes de firma de las células beta reveló aproximadamente el 25% de las células que expresan Nkx6.1 y el 40% que expresan Pdx1. Durante el ensayo de secreción de insulina estimulada por glucosa, los grupos derivados de MEL1 secretaron niveles significativamente más altos de insulina en respuesta a concentraciones altas de glucosa en comparación con concentraciones bajas de glucosa.
