La principal ventaja de esta técnica es que antes de la estimulación, las células se dispersan uniformemente y luego se estimulan uniformemente en la adhesión celular en tándem. Demostrando el procedimiento estará Azuma Kimura, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, transfiera seis mililitros de RPMI 1640 a un tubo enfriado a cuatro grados Celsius sobre hielo.
Usando puntas de pipeta de un mililitro enfriada, agregue dos miligramos de matriz de membrana del sótano. Mezclar bien por pipeteo suave para que sea una matriz de membrana sótano con una concentración de 0.33 miligramos por mililitro. A continuación, utilice una pipeta para transferir dos mililitros de la matriz de membrana del sótano diluido a cada pozo de una placa de cultivo celular de seis pozos.
Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 60 a 90 minutos. Después de esto, mantenga la placa a temperatura ambiente durante un máximo de tres horas, hasta que esté lista para usar. En primer lugar, aspirar el medio utilizado y utilizar una pipeta para añadir dos mililitros de EDTA de 0,5 milimolares a cada pozo para lavar los hPCS cultivados en la placa de seis pozos.
A continuación, aspirar el EDTA de los pozos y añadir dos mililitros de EDTA fresco de 0,5 milimolar a cada pozo. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de esto, aspirar el EDTA de cada pozo.
Añadir un mililitro de medio de mantenimiento hPSC a temperatura ambiente, complementado con 10 micromolares Y27632 a cada pocólimo. Pipetear suavemente pero rápidamente para soplar las células adheridas en la placa y para disociar las células agrupadas en células individuales. Transfiera la suspensión celular en un tubo centrífugo de 50 mililitros que contenga cuatro mililitros de medio de mantenimiento hPSC complementado con 10 micromolares Y27632 por pozo y mezcle por pipeteo.
A continuación, mezclar 15 microlitros de suspensión celular con 15 microlitros de color azul tripano en el tubo. Utilice una pipeta de 10 microlitros para transferir 10 microlitros de la suspensión celular diluida a las diapositivas de conteo celular por duplicado. Usando un contador de celda automatizado, cuente el número de celda y calcule la densidad de celdas en la suspensión celular.
Asigne la suspensión celular en un tubo de 50 mililitros a una densidad de uno a un millón y medio de células para cada pozo que se va a utilizar. Centrifugar el tubo a 200 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de esto, utilice una pipeta para aspirar el sobrenadante y re-suspender las células usando un mililitro de media de etapa 1A por pozo.
Pipetear suavemente la suspensión celular y luego añadir otro mililitro de la etapa 1A medio por pozo. Usando una pipeta de 1000 microlitros, aspirar la matriz de membrana del sótano diluido de los pozos de la placa de cultivo celular previamente preparada. Pipetee inmediatamente la suspensión en el tubo suavemente y transfiera dos mililitros a cada pozo de una placa de seis pozos.
Cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz y coloque la placa en un banco limpio a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Después de esto, transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y una atmósfera humidificada durante 24 horas. En primer lugar, agitar suavemente la placa y utilizar una pipeta para aspirar el medio utilizado.
A continuación, agregue dos mililitros de DPBS a cada pozo. Agitar suavemente la placa de nuevo y aspirar el DPBS utilizado. Añadir cuatro mililitros de la etapa 1B medio, precalegado a 37 grados Celsius, a cada pozo.
Transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y una atmósfera humidificada al cultivo durante 48 horas. Después de esto, agitar suavemente la placa y aspirar el medio utilizado. Agregue dos mililitros de DPBS a cada pozo.
Repita esta aspiración y adición de DPBS una vez adicional. Agitar suavemente la placa y aspirar el DPBS usado. Añadir cuatro mililitros de la etapa 1B medio, precalegado a 37 grados Celsius, a cada pozo.
Transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora, a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y una atmósfera humidificada al cultivo durante 24 horas. En primer lugar, agitar suavemente la placa y aspirar el medio utilizado. Agregue dos mililitros de DPBS a cada pozo de la placa de seis pozos.
A continuación, agitar suavemente la placa y aspirar el DPBS usado. Añadir cuatro mililitros de la etapa dos mediana, precale calentado a 37 grados Celsius, a cada pozo. Transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y una atmósfera humidificada al cultivo durante cuatro días.
Agitar suavemente la placa y aspirar el medio utilizado. Agregue dos mililitros de DPBS a cada pozo. Repita este proceso de aspirar y agregar DPPS una vez más.
Después de esto, agitar suavemente la placa y aspirar el DPBS usado. Añadir cuatro mililitros de la tercera etapa medio, precalegado a 37 grados Celsius, a cada pozo. Transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y una atmósfera humidificada al cultivo durante tres días.
En este estudio, los hIPSEs de propagación se condensan y forman una monocapa homogénea que es adecuada para la diferenciación. Los hIPSEs indiferenciados se disoccian y se vuelven a sembrar como células individuales a densidades celulares bajas. Dentro de una hora, las células se unen a la placa y comienzan a mostrar protuberancia.
En el primer día, las células son proliferadas y bien distribuidas para cubrir entre el 80 y el 90% de la superficie. En los días tres y cuatro, las células forman una lámina monocapa homogénea que se puede describir como una apariencia de adoquines. En este punto, la mayoría de las células dejan de expresar SOX2, que es un marcador para las células indiferenciadas, y en su lugar expresan un marcador de endodermo definitivo, SOX17, en más del 90%La mayoría de las células SOX17 positivas expresan FOXA2.
Luego las células comienzan a expresar los marcadores de goptupe primitivos, HNF1-beta y HNF4-alpha, y finalmente expresan un marcador progenitor pancreático posterior, PDX1, a más del 90%La inducción de células PDX1 positivas es reproducible en otra línea hIPSE, 1231A3, y una línea hESE, KhES-3. Los resultados QRTPCR de la expresión DE MRNA de los marcadores de etapa son consistentes con la inmunostaining y la expresión MRNA de PDX1 es evidente en la etapa tres y aumenta sustancialmente después. Dado que las células ESIPS indiferenciadas se cultivan como colonias, las células individuales se encuentran localmente en un estado diferente.
Este protocolo proporciona una manera de estimular las células uniformemente para la diferenciación elegida.
