Ines Cherkaoui는 Diabetes UK 학생(BDA 18/0005934)의 지원을 받아 GAR에 지원했으며, Wellcome Trust의 Investigator Award(212625/Z/18/Z), UKRI MRC의 프로그램 보조금(MR/R022259/1), Diabetes UK의 프로젝트 보조금(BDA16/0005485), 창업 자금의 CRCHUM, John R. Evans Leader Award(CFI 42649)의 Innovation Canada에도 감사를 표합니다. 프로젝트 보조금의 경우 NIH-NIDDK(R01DK135268), 팀 보조금의 경우 CIHR, JDRF(CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N)을 참조하십시오. 카밀 디온(Camille Dion)과 해리 리치(Harry Leitch) 박사는 런던의 NIHR Imperial BRC(Biomedical Research Centre) 오가노이드 시설에서 인간 hiPSC 생성 및 배양에 도움을 주었습니다.

인간 만능줄기세포를 췌장 β세포로 분화시키기

<ol>
	<li>Kolios, G., Moodley, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+stem+cells+and+regenerative+medicine.">Introduction to stem cells and regenerative medicine.</a> Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+routes+to+the+generation+of+functional+&#946;-cells+for+diabetes+mellitus+cell+therapy.">Emerging routes to the generation of functional &#946;-cells for diabetes mellitus cell therapy.</a> Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).</li><li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Cell+Replacement+in+mice+using+human+Type+1+diabetes+nuclear+transfer+embryonic+stem+cells.">&#946;-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells.</a> Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+pancreatic+&#946;-cells+from+multiple+human+stem+cell+lines.">Generation of insulin-producing pancreatic &#946;-cells from multiple human stem cell lines.</a> Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+islet-like+clusters+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).</li><li>Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+&#946;-cell+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Pancreatic &#946;-cell differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68 (2018).</li><li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+replication+fork+speed+promotes+pancreatic+endocrine+differentiation+and+controls+graft+size.">Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size.</a> JCI Insight. 6 (5), 141553 (2021).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+&#946;-cell+differentiation.">Charting cellular identity during human in vitro &#946;-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li><li>Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+specialisations+of+the+pancreatic+&#946;-cell:+gene+disallowance,+mitochondrial+metabolism+and+intercellular+connectivity.">Metabolic and functional specialisations of the pancreatic &#946;-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity.</a> Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).</li><li>Micallef, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INS(GFP/w)+human+embryonic+stem+cells+facilitate+isolation+of+in+vitro+derived+insulin-producing+cells.">INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells.</a> Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).</li><li>Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+KGF+is+FGF-related+with+properties+of+a+paracrine+effector+of+epithelial+cell+growth.">Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth.</a> Science. 245 (4919), 752-755 (1989).</li></ol>

hPSC를 췌장 β세포로 성공적으로 분화하는 것은 선택된 hPSC의 일상적인 배양 및 통과의 모든 측면을 최적화하는 데 달려 있습니다. 여기에는 세포주가 정상적인 핵형을 가지고 있는지, 마이코플라스마 감염에 대해 음성인지, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 게놈이 없는지 확인하는 것이 포함됩니다. 또한, hiPSC를 사용할 때는 파일럿 실험을 위해 아직 재프로그래밍이 진행 중인 가장 빠른 통로를 ?...

인간 만능 줄기세포(hPSC)는 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 고유한 능력을 가지고 있어 인간 췌장 β세포의 유력한 대안이 될 수 있습니다1. 이러한 hPSC는 배반포에서 유래한 배아줄기세포(hESC)로 분류된다.2 체세포를 직접 재프로그래밍하여 생성된 유도만능세포(hiPSC)3. hPSC를 β세포로 분화하는 기술의 개발은 기초 연구와 임상 실습 모두에 중요한 영향을 미칩니다 1,4. 진성 당뇨병은 전 세계적으로 4억 > 사람들에게 영향을 미치는 만성 질환으로, 췌장 β세포의 기능 장애 또는 손실로 인해 신체가 혈당을 조절하지 못해 발생합니다5. 이식을 위한 췌장 섬 세포의 제한된 가용성은 당뇨병에 대한 세포 대체 요법의 개발을 방해했습니다 2,4,6,7. hPSC를 사용하여 포도당 반응성 인슐린 분비 세포를 생성하는 능력은 인간 섬 발달 및 기능을 연구하는 데 유용한 세포 모델 역할을 합니다. 또한 통제된 환경에서 당뇨병 치료를 위한 잠재적인 치료 후보를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 hPSC는 환자와 유전적으로 동일한 췌장 섬 세포를 생산할 수 있는 잠재력이 있어 이식 후 면역 거부 반응의 위험을 줄일 수 있습니다 2,4,7.
최근 몇 년 동안 hPSC 배양 및 분화 프로토콜의 정교화가 크게 발전하여 췌장 β 세포 생성을 위한 분화 과정의 효율성과 재현성이 향상되었습니다 8,9.
다음 프로토콜은 췌장 β 세포의 직접 분화의 필수 단계를 간략하게 설명합니다. 여기에는 뚜렷한 시점에서 특정 세포 신호 전달 경로의 조절이 포함됩니다. 이는 Sui L. et al.10 (2018)이 췌장 β세포로 hPSC를 생성하기 위해 개발한 프로토콜을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 Sui L. et al.11 (2021)의 최신 업데이트에 따라 조정되었으며, 최신 연구는 β 세포의 분화를 향상시키기 위해 아피디콜린(APH) 치료를 사용하는 것의 중요성을 강조합니다. 현재 프로토콜에는 프로세스의 후반 단계에서 매체에 APH를 추가하는 것이 포함됩니다. 또한, 초기 프로토콜과 비교하여 분화의 초기 단계에서 배지의 구성에 수정이 이루어졌습니다. 주목할 만한 변화는 6일째에 각질세포 성장인자(KGF)가 추가되어 8일째까지 지속된다는 것입니다. 각질세포 성장인자(KGF)는 6일째에서 8일째까지 도입되는데, 이는 KGF가 4기 배지에 포함되지 않았던 초기 프로토콜10과 약간 다릅니다.
β세포 유사 세포 생성의 첫 번째이자 필수적인 단계는 hPSC를 췌장을 포함한 다양한 장기의 상피 내벽을 형성하는 원시 생식층인 최종 내배엽(DE)으로 직접 분화하는 것입니다. DE가 형성된 후, 세포는 원시적인 장관으로 분화되고, 그 후 후장 운명의 사양이 뒤따릅니다. 그런 다음 후방 전창자는 췌장 전구 세포로 발달하며, 내분비 및 외분비 세포를 포함한 췌장의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 과정의 후속 단계는 랑게르한스 섬에서 발견되는 호르몬 분비 세포를 생성하는 췌장 내분비 전구 세포와 관련이 있습니다. 결국, 분화 과정은 완전히 기능하는 췌장 β 세포와 같은 세포 9,10을 생성함으로써 최종 단계에 도달합니다. 이 과정은 복잡하고 분화의 효율성과 특이성을 향상시키기 위해 특정 성장 인자 및 세포외 기질 성분과 같은 배양 조건의 최적화가 필요한 경우가 많다는 점에 유의하는 것이 중요합니다 9,10. 또한, 체외에서 hPSC로부터 기능성 β-세포와 유사한 세포를 생성하는 것은 여전히 중요한 과제입니다. 진행 중인 연구는 분화 프로토콜을 개선하고 그 결과로 생성된 β-세포의 성숙과 기능을 향상시키는 데 초점을 맞추고있다 9.
이 프로토콜에서는 hPSC의 배양 및 통과 과정에서 부드러운 세포 해리를 사용하는 것이 세포 생존력과 다능성을 유지하는 데 필수적이며, 췌장 β 세포로의 분화 효율성을 크게 향상시킵니다. 또한, 각 병기 특이적 배지는 Sui L. et al.10 이 개발한 프로토콜에 따라 세심하게 최적화되어 인간 섬과 매우 유사한 클러스터에서 인슐린 분비 세포의 높은 수율을 촉진합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Starlabs</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 6-well plate&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glucagon&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G2654-100UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Insulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NKX6.1</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-49672SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PDX1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab84987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aphidicolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3803-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/Magnesium free D-PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine-KAAD</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>239804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose,BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94046-100ML-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM plus GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566016</td>
			<td>For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-Secretase Inhibitor XX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J64904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG4582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0559-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound 118 mL</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, 22&#215;50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RepSox (Hydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870036</td>
			<td>For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Immu-mount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Endoderm&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4&#176;C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule All-Trans Retinoic Acid</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroid Tormone 3 (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>38071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized protocol for generating functional pancreatic insulin-secreting cells from human pluripotent stem cells

인간 만능 줄기 세포(hPSC)는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있어 인간 췌장 β 세포의 훌륭한 대체 공급원입니다. hPSC는 배반포에서 유래한 배아 줄기 세포(hESC) 또는 재프로그래밍 과정을 사용하여 체세포에서 직접 생성된 유도 만능 세포(hiPSC)일 수 있습니다. 여기에서는 hPSC의 분화 및 인슐린 생산 췌장 세포의 후속 생성 전에 hPSC에 대한 최적의 배양 및 통과 조건을 설명하기 위해 비디오 기반 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 hPSC가 최종 내배엽(DE), 원시 장관, 후장 운명, 췌장 전구 세포, 췌장 내분비 전구 세포, 궁극적으로 췌장 β 세포로 분화하는 β세포 유도 분화를 위한 6단계 과정을 따릅니다. 이 분화 방법론은 인간 췌장 β 세포를 생성하는 데 27일이 걸린다는 점은 주목할 만합니다. 인슐린 분비의 잠재력은 면역염색과 포도당 자극 인슐린 분비를 포함한 두 가지 실험을 통해 평가되었습니다.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the unique ability to differentiate into various cell types, making them a viable alternative to human pancreatic &#946;-cells1. These hPSCs are categorized into two types: embryonic stem cells (hESCs), derived from the blastocyst2, and induced pluripotent cells (hiPSCs), generated by reprogramming somatic cells directly3. The development of techniques to differentiate hPSCs into &#946;-cells, has important implications for both fundamental research and clinical practice1,4. Diabetes mellitus is a chronic disease affecting &#62;400 million people worldwide and results from the inability of the body to regulate glycemia due to malfunction or loss of pancreatic &#946;-cells5. The limited availability of pancreatic islet cells for transplantation has hindered the development of cell replacement therapies for diabetes2,4,6,7. The ability to generate glucose-responsive insulin-secreting cells using hPSCs serves as a useful cellular model for studying human islet development and function. It can also be used to test potential therapeutic candidates for diabetes treatment in a controlled environment. Moreover, hPSCs have the potential to produce pancreatic islet cells that are genetically identical to the patient, reducing the risk of immune rejection after transplantation2,4,7.
In recent years, there have been significant advancements in the refinement of hPSC culture and differentiation protocols, resulting in increased efficiency and reproducibility of the differentiation process toward generating pancreatic &#946;-cells8,9.
The following protocol outlines the essential stages of directed differentiation of pancreatic &#946;-cells. It involves the regulation of specific cell signaling pathways at distinct time points. It is based on the protocol developed by Sui L. et al.10 (2018) for the generation of hPSCs into pancreatic &#946;-cells. The protocol was adjusted to recent updates from Sui L. et al.11 (2021), as the latest research emphasizes the significance of using aphidicolin (APH) treatment to enhance the differentiation of &#946;-cells. The current protocol includes the addition of APH to the medium during the later stages of the process. Furthermore, modifications have been made to the composition of the medium during the early stages of differentiation compared to the initial protocol. A notable change is the addition of Keratinocyte Growth Factor (KGF) on Day 6 and continuing until Day 8. The keratinocyte growth factor (KGF) is introduced from day 6 to day 8, which slightly differs from the initial protocol10, where KGF was not included in the stage 4 medium.
The first and essential step in the generation of &#946;-cell-like cells is the directed differentiation of hPSCs into definitive endoderm (DE), a primitive germ layer that gives rise to the epithelial lining of various organs, including the pancreas. After the formation of DE, the cells undergo differentiation into the primitive gut tube, which is followed by the specification of the posterior foregut fate. The posterior foregut then develops into pancreatic progenitor cells, which have the potential to differentiate into all cell types of the pancreas, including the endocrine and exocrine cells. The subsequent stage in the process involves pancreatic endocrine progenitors giving rise to the hormone-secreting cells found in the islets of Langerhans. In the end, the differentiation process reaches its final stage by producing fully functional pancreatic &#946;-cell like cells9,10. It is important to note that this process is complex and often requires optimization of the culture conditions, such as specific growth factors and extracellular matrix components, to improve the efficiency and specificity of differentiation9,10. Furthermore, generating functional &#946;-cell like cells from hPSCs in vitro is still a major challenge. Ongoing research focuses on improving differentiation protocols and enhancing the maturation and function of the resulting &#946;-cells9.
In this protocol, the use of gentle cell dissociation during the culture and passage of hPSCs is essential to maintain cell viability and pluripotency, significantly improving the efficiency of differentiation into pancreatic &#946;-cells. Additionally, each stage-specific medium has been meticulously optimized following the protocol developed by Sui L. et al.10 to promote a high yield of insulin-secreting cells in clusters that closely resemble the human islet.

저자 스포트라이트: 만능줄기세포와의 β세포 분화의 발전과 과제

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

Attaining a high and consistent efficiency in the differentiation process for converting pluripotent stem cells into human beta cells is a notable challenge. This challenge is influenced by the precision and the consistency with which the experimenter follows the protocol. Moreover, the amount of beta cells obtained in each experiment is quite variable, which may result in the reduced function of beta cells across multiple experiments.In the context of high leptin beta cell research in diabetes, the availability of cadaveric eyelet donors is quite limited. Consequently, the use of stem cell differentiated beta cells is offering an unlimited and abundant supply of insulin secreting cells. Beta cell differentiation is a pivotal advancement in our field, offering numerous benefits.It allows us to explore the development and function of beta cells, leading to a deeper understanding of diabetes causes and beta cell dysfunction. We aim to use this technique for our research focusing on the genetics of diabetes. Our primary objective is to focus on mutation of certain genes that can influence beta cells and eyelet function.So this protocol will facilitate the access to human eyelet derived from pre-potent stem cells with mutations of interest.

이 논문에 기술된 프로토콜은 hPSC에서 β-유사 세포를 구별하기 위한 매우 효율적인 접근법을 제공한다10. 이 공정은 쉽게 확장할 수 있는 2D 배양 시스템을 활용하여 차별화 학습, 소규모 프로젝트 및 실험실, 차별화를 위한 iPSC 라인의 잠재력을 평가하기 위한 파일럿 테스트와 같은 다양한 실험 환경에서 사용할 수 있습니다.
포도당 항상성에 대한 통찰력을 ?...

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이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic ...

만능 줄기 세포를 인간 베타 세포로 전환하기 위한 분화 과정에서 높고 일관된 효율성을 달성하는 것은 주목할 만한 과제입니다. 이 문제는 실험자가 프로토콜을 따르는 정밀도와 일관성의 영향을 받습니다. 또한, 각 실험에서 얻어지는 베타 세포의 양은 매우 다양하기 때문에 여러 실험에서 베타 세포의 기능이 저하될 수 있습니다.당뇨병에서 높은 렙틴 베타 세포 연구의 맥락에서 사체 작은 구멍 기증자의 가용성은 매우 제한적입니다. 결과적으로, 줄기세포 분화 베타세포의 사용은 인슐린 분비 세포의 무제한적이고 풍부한 공급을 제공하고 있습니다. 베타 세포 분화는 우리 분야에서 중추적인 발전이며 수많은 이점을 제공합니다.이를 통해 베타 세포의 발달과 기능을 탐구할 수 있어 당뇨병의 원인과 베타 세포 기능 장애에 대해 더 깊이 이해할 수 있습니다. 우리는 당뇨병의 유전학에 초점을 맞춘 연구에 이 기술을 사용하는 것을 목표로 합니다. 우리의 주요 목표는 베타 세포와 작은 구멍 기능에 영향을 미칠 수 있는 특정 유전자의 돌연변이에 초점을 맞추는 것입니다.따라서 이 프로토콜은 관심 있는 돌연변이가 있는 전능 줄기 세포에서 유래한 인간 구멍에 대한 접근을 용이하게 할 것입니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells

1.3K 조회수.  Cell Biology and Functional Genomics. 만능 줄기 세포를 인간 베타 세포로 전환하기 위한 분화 과정에서 높고 일관된 효율성을 달성하는 것은 주목할 만한 과제입니다. 이 문제는 실험자가 프로토콜을 따르는 정밀도와 일관성의 영향을 받습니다. 또한, 각 실험에서 얻어지는 베타 세포의 양은 매우 다양하기 때문에 여러 실험에서 베타 세포의 기능이 저하될 수 있습니다.당뇨병에서 높은 렙틴 베타 세포 연?...

비디오: 저자 스포트라이트: 만능줄기세포와의 β세포 분화의 발전과 과제

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic &#946;-cells. hPSCs can either be embryonic stem cells (hESCs) derived from the blastocyst or induced pluripotent cells (hiPSCs) generated directly from somatic cells using a reprogramming process. Here a video-based protocol is presented to outline the optimal culture and passage conditions for hPSCs, prior to their differentiation and subsequent generation of insulin-producing pancreatic cells. This methodology follows the six-stage process for &#946;-cell directed differentiation, wherein hPSCs differentiate into definitive endoderm (DE), primitive gut tube, posterior foregut fate, pancreatic progenitors, pancreatic endocrine progenitors, and ultimately pancreatic &#946;-cells. It is noteworthy that this differentiation methodology takes a period of 27 days to generate human pancreatic &#946;-cells. The potential of insulin secretion was evaluated through two experiments, which included immunostaining and glucose-stimulated insulin secretion.

This article presents a protocol for directed differentiation and functional analysis of &#946;-cell like cells. We describe optimal culture conditions and passages for human pluripotent stem cells before generating insulin-producing pancreatic cells. The six-stage differentiation progresses from definitive endoderm formation to functional &#946;-cell like cells secreting insulin in response to glucose.