Para empezar, añade una solución de tripsina-EDTA al 0,25% a las células HeLa e incuba a 37 grados centígrados durante dos o tres minutos. Disocie suavemente las células mediante pipeteo y siembre en nuevas placas en una proporción de uno a cuatro para el paso celular. Para transfectar el plásmido en células HeLa, mezcle un microgramo de plásmido de sgRNA PX458 validado, con 50 microlitros de medio sérico reducido en el tubo A.In el tubo B, mezcle suavemente dos microlitros del reactivo de transfección y 50 microlitros de medio sérico reducido e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Luego, combine el contenido de los tubos A y B e incube a temperatura ambiente durante otros cinco minutos. Agregue la mezcla a la placa de 12 pocillos e incube las células a 37 grados centígrados durante seis horas. Al final de la incubación, reemplace el medio con medio DMEM fresco.
Después de 24 o 48 horas, evalúe la eficiencia de la transfección examinando las células HeLa bajo un microscopio de fluorescencia. Disocie completamente las células HeLa transfectadas utilizando EDTA al 0,25% de tripsina e incube a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. A continuación, cuente las células utilizando una cámara de Neubauer o un contador de células automatizado.
Coloque las células en tres placas separadas de 96 pocillos para cada población transfectada siguiendo métodos de dilución en serie. Regrese las células a una incubadora humidificada durante una o dos semanas. Para el cribado basado en el fenotipo y la validación de CENP-E Knockout, disocie y expanda las células en placas de 24 o 12 pocillos durante cinco a siete días.
Examinar las células mutantes con diámetros de colonia más pequeños utilizando un microscopio invertido con lentes de objetivo de aumento de 10 y 20 aumentos. A continuación, recoja las células para la extracción de ADN empleando el kit de extracción de ADN genómico animal en columna siguiendo las instrucciones del fabricante y configure las reacciones en cadena de la polimerasa. Libar el ADN objetivo en el vector pMD18-T según lo indicado por los protocolos del fabricante.
Transfectar el plásmido ligado en células DH5-Alfa competentes y proceder con el cultivo para la selección de clones. Para identificar los tipos de CENP-E Knockout, aísle el ADN plasmídico con la ayuda de un kit de extracción de plásmidos siguiendo las pautas del fabricante. A continuación, realice la secuenciación Sanger del ADN plasmídico de cada colonia utilizando cebadores M13 hacia adelante y hacia atrás.
Siembre las células HeLa de tipo salvaje y mutantes CENP-E en hojas de cubierta de vidrio de 12 milímetros en una placa de 24 pocillos. Retire el medio DMEM completo y fije las células con una solución de paraformaldehído al 4% y PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, tiñe los núcleos con DAPI a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Observar y validar las células mutantes de CENP-E en función del fenotipo de alineación cromosómica utilizando un microscopio de fluorescencia. El cribado fenotípico de las colonias mostró que las células CENP-E Knockout mostraron una mayor desalineación cromosómica en comparación con el grupo control.
