Генерация центромер-ассоциированных белков-E CENP-E^-/- нокаутных клеточных линий с использованием системы CRISPR/Cas9

Генетическая делеция кинезина-7 и CENP обычно приводит к остановке клеточного цикла и гибели клеток. Построение стабильных клеточных линий с нокаутом CENP является важной нерешенной проблемой в биологии CENP. В этом исследовании мы получили нокаутные клетки HeLa CENP с помощью системы CRISPR/Cas9 и разработали три оптимизированные стратегии скрининга.

В последнее время несколько технологий редактирования генома, в том числе нуклеазы с цинковыми пальцами, эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции, и то, как мы производим наши нуклеазы, были разработаны для расщепления геномов в определенном размере. Технология нокаута генов CRISPR/Cas9 произвела революцию в биологии, биотехнологии и медицине. CENP необходим для прикрепления кинетохоров к микротрубочкам и выравнивания хромосом.

Нарушение CENP, будь то путем микроинъекции антител, делеции sgRNC, химического ингибирования или генетической делеции, приводит к смещению хромосом, митотическим дефектам и часто гибели клеток, что усложняет изучение белковых механизмов CENP. В этом исследовании были разработаны три оптимизированные стратегии скрининга, основанные на фенотипах, включая скрининг клеточных колоний, выравнивание фенотипов хромосом и интенсивность флуоресценции белков CENP, что повысило эффективность скрининга и вероятность успеха эксперимента. Важно отметить, что делеция CENP приводит к смещению хромосом, аномальному расположению белков BubR1 и митотическим дефектам.

Режимы взаимодействия и молекулярные механизмы CENP и его ингибиторов являются важными направлениями исследований в клеточной биологии и исследованиях рака. В этом исследовании была установлена клеточная линия HeLa с нокаутом CENP в качестве ценного инструмента для валидации специфичности и токсичности ингибиторов CENP.