Fujian Tıp Üniversitesi'ndeki Hücre İskeleti Laboratuvarı'nın tüm üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknoloji Hizmet Merkezi'nden Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin ve Min-Xia Wu'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Deneysel Öğretim Merkezi'nden Si-Yi Zheng, Ying Lin ve Qi Ke'ye destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası 82001608 ve 82101678), Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (hibe numarası 2019J05071), Bilim ve Teknoloji İnovasyonu için Ortak Fonlar, Fujian Eyaleti, Çin (hibe numarası 2021Y9160) ve Fujian Tıp Üniversitesi üst düzey yetenekler bilimsel araştırma başlangıç fonu projesi (hibe numarası XRCZX2017025).

1. CRISPR/Cas9 gen nakavt vektörlerinin oluşturulması
<ol><li>İnsan CENP-E genindeki hedef genomik DNA dizisini seçin (GenBank Erişim No. NM_001286734.2) ve çevrimiçi bir CRISPR tasarım aracı (http://crispor.tefor.net/) kullanarak sgRNA'yı tasarlayın.</li>
	<li>Tek bir genomik dizi girin, "Homo sapiens-insan-UCSC Aralık 2013 (hg38 analiz seti) + tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler): dbSNP148" genomunu seçin ve "20 bp-NGG-spCas9" protospacer bitişik motifini seçin. Özgüllük skorları50, tahmin edilen verimlilik10 ve minimum hedef dışı değerlere göre sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' ve sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGCTC-3' dahil olmak üzere iki kılavuz dizisi seçin.</li>
	<li>Tek sarmallı DNA oligonükleotidlerini (ssODN'ler) sıralayın ve sentezleyin. ssODN'leri ddH2O'da100 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpüne sgRNA oligolarını fosforile etmek ve tavlamak için 1 μL ileri oligo, 1 μL ters oligo, 0.5 μL T4 polinükleotid kinaz, 1 μL T4 polinükleotid kinaz tamponu ve 6.5 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve tüpü 37 °C'de 30 dakika, 95 °C'de 5 dakika inkübe edin; daha sonra 5 °C dk-1'de 25 °C'ye kadar rampa yapın.</li>
	<li>Bbs kısıtlama enzimini kullanarak pX458 plazmitini<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65476/65476eq01.jpg" style="margin: auto;"> sindirin. 1 μg pX458 plazmid, 2 μL 10x tampon G, 1 μL Bbs<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65476/65476eq01.jpg" style="margin: auto;"> ekleyin ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne RNaz içermeyen ddH2O'yu 20 μL'ye ekleyin. Tüpü 37 °C'de 2 saat inkübe edin. Ardından, üreticinin protokollerine göre kolon DNA jel ekstraksiyon kitini kullanarak doğrusal plazmidi saflaştırın.</li>
	<li>sgRNA oligolarını pX458 plazmidine bağlayın (pSpCas9(BB)-2A-yeşil floresan protein (GFP) plazmidi, Addgene ID. 48138). 1 μL tavlanmış oligonükleotid, 25 ng lineer plazmit, 1 μL 10x T4 DNA ligasyon tamponu, 0.5 μL T4 DNA ligaz (350 U/μL) ekleyin ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde ddH2Oile 10 μL'ye kadar yapın. Ligasyon çözeltisini 16 °C'de 2 saat inkübe edin.</li>
	<li>Oluşturulan plazmitin 10 μL'sini yetkin DH5α hücreleri ile buz üzerinde 30 dakika, 42 °C'de 45 saniye ısı şoku ile inkübe edin ve hemen 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. 500 μL Luria-Bertani (LB) ortamı ekleyin ve hücreleri ampisilin (100 μg / mL) içeren bir LB plakasına tohumlayın. 37 ° C'de 16 saat inkübe edin ve dirençli klonları eleyin.</li>
	<li>Sterilize edilmiş bir pipet ucu ile 5-10 tek koloni seçin ve bunları ampisilinli (100 μg/mL) 1 mL LB ortam kültürüne aktarın. Kültürü 37 °C'de inkübe edin ve 180 rpm'de 12-16 saat çalkalayın.</li>
	<li>Üreticinin protokollerine göre bir plazmit ekstraksiyon kiti kullanarak plazmit DNA'yı izole edin. U6-Fwd primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' kullanarak U6 promotör bölgesinden Sanger dizilimi ile her koloninin plazmit DNA'sını doğrulayın.</li>
	<li>Üreticinin protokollerine göre endo-içermeyen plazmid DNA kitini kullanarak plazmitleri ekstrakte edin ve saflaştırın.</li>
</ol>2. CENP-E nakavt HeLa hücrelerinin transfeksiyonu, izolasyonu ve taranması
<ol><li>Dulbecco Modifiye Eagle's Medium'daki (DMEM) kültür HeLa hücreleri, %5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiştir.</li>
	<li>HeLa hücrelerini %0.25 tripsin/etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) kullanarak 37 °C'de 2-3 dakika inkübe edin, hücreleri nazikçe pipetleyerek ayırın ve ardından hücreleri hücre geçişi için 1:4 seyreltme oranında yeni plakalara tohumlayın.</li>
	<li>Hücreleri 12 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve transfeksiyondan önce% 60-70 birleşmeye kadar kültürleyin. pX458-sgRNA plazmitlerini, üreticinin protokollerine göre referans verilen reaktifleri kullanarak HeLa hücrelerine aktarın (Malzeme Tablosuna bakın).<ol><li>Tüp A'da 1 μg doğrulanmış pX458-sgRNA plazmidi ve 50 μL indirgenmiş serum ortamını nazikçe karıştırın. Daha sonra, 2 μL transfeksiyon reaktifi ve 50 μL indirgenmiş serum ortamını B tüpünde nazikçe karıştırın.</li>
		<li>Hem tüp A'yı hem de tüp B'yi hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Karışımı 12 oyuklu bir plakaya ekleyin, hücreleri 6 saat inkübe edin ve ortamı taze bir DMEM ortamı ile değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfeksiyon verimliliği için bir floresan mikroskobu kullanarak 24 saat veya 48 saat sonra HeLa hücrelerini inceleyin. 48 saat boyunca transfeksiyondan sonra, transfekte edilen HeLa hücrelerini 3-5 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin / EDTA kullanarak tamamen ayırın, bir Neubauer odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın ve hücreleri, seri seyreltme yöntemlerine göre her transfekte edilen popülasyon için üç ayrı 96 oyuklu plakaya yerleştirin10.</li>
	<li>Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatöre geri koyun ve ardından 1-2 hafta daha kültürleyin. Kültür ortamını her 3 günde bir değiştirin. CENP-E nakavtının fenotipe dayalı taraması ve doğrulanması için, hücreleri 5-7 gün boyunca 24 oyuklu veya 12 oyuklu plakalarda ayırın ve genişletin.</li>
	<li>10x ve 20x objektif lenslerle donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak daha küçük hücre kolonisi çaplarına sahip mutant hücreleri tarayın. NOT: CENP-E mutasyonları genellikle hücre kolonilerindeki bölünen hücrelerin sayısında önemli bir artışa neden olur, bu da CENP-E mutant hücrelerinin taranması için anahtar göstergelerden biri olabilir.</li>
	<li>Üreticinin protokollerine göre sütun hayvan genomik DNA ekstraksiyon kitini kullanarak DNA ekstraksiyonu için hücreleri hasat edin. PCR reaksiyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 0.25 μL Taq polimeraz, 5 μL 10x tampon (Mg2+ plus), 4 μL dNTP karışımları, 500 ng DNA şablonu, 1 μL ileri oligo, 1 μL ters oligo ve ddH2O'yu 50 μL'ye ayarlayın. Gen amplifikasyonu için aşağıdaki PCR program ayarlarını kullanın: 98 °C, 10 sn; 33 döngü için 98 °C, 10 sn, 55 °C, 30 sn, 72 °C, 60 sn; 72 °C, 10 dakika ve ardından 4 °C'de tutun. NOT: Hedef lokusun klonlanması için spesifik primerler aşağıdaki gibi listelenmiştir: CENP-E hedef F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E hedefi R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; CENP-E hedefi F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E hedefi R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.</li>
	<li>Hedef DNA'yı üreticinin protokollerine göre pMD18-T vektörüne bağlayın. Bağlanmış plazmiti yetkin DH5α hücrelerine ve klonların seçimi için kültüre aktarın.</li>
	<li>CENP-E nakavt türlerini belirlemek için Sanger sıralaması gerçekleştirin. Üreticinin protokollerine göre bir plazmit ekstraksiyon kiti kullanarak plazmit DNA'yı izole edin. M13 ileri ve geri primerlerini kullanarak her koloninin plazmit DNA'sının Sanger dizilimini gerçekleştirin. M13F astar, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; M13R astar, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.</li>
	<li>Yabani tip ve CENP-E mutant HeLa hücrelerini, sırasıyla 24 oyuklu bir plakada 12 mm'lik cam lameller üzerine tohumlayın. DMEM ortamının tamamını çıkarın ve hücreleri% 4 paraformaldehit / fosfat tamponlu salin (PBS) fiksatif çözeltisinde oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin.</li>
	<li>Çekirdekleri oda sıcaklığında 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi ile 5 dakika boyayın. Plan Fluor 40x/ Numerical Aperture (NA) 0.75 objektif ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak kromozom hizalama fenotipine dayalı olarak CENP-E mutant hücrelerini tarayın ve doğrulayın.</li>
	<li>CENP-E proteinlerinin immünofloresan boyama ve analizini (bkz. bölüm 3) kullanarak CENP-E nakavt hücrelerini tarayın ve doğrulayın.</li>
</ol>3. İmmünofloresan boyama ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi
<ol><li>Hücreleri %4 paraformaldehit/PBS fiksatif solüsyonu ile oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin ve 2 x 5 dakika 1x PBS'ye daldırın. NOT: Metafaz hücre ayrılmasını önlemek için hücrelerin sağlıklı durumda olduğundan ve hücrelerin nazikçe toplanıp sabitlendiğinden emin olun.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında %0.25 Triton X-100/PBS ile 10 dakika geçirgen hale getirin ve 2 x 5 dakika boyunca 1x PBS'ye daldırın.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %1 BSA/PBST (PBS'de %0.1 Tween 20) ile bloke edin. Primer antikorları %1 BSA/PBST ile seyreltin ve numuneleri 4 °C'de 12 saat inkübe edin.</li>
	<li>Birincil antikor çözeltilerini atın, hücreleri 3 x 5 dakika 1x PBS ile durulayın ve hücreleri seyreltilmiş ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.</li>
	<li>İkincil antikorları atın ve hücreleri 1x PBS'de 3 x 5 dakika durulayın.</li>
	<li>Çekirdekleri DAPI ile oda sıcaklığında 5 dakika boyayın. Kızakları montaj ortamıyla monte edin. Slaytları oje ile kapatın.</li>
	<li>63x/NA 1.40 objektif ile donatılmış bir taramalı konfokal mikroskop kullanarak floresan görüntülerini gözlemleyin ve kaydedin.</li>
</ol>4. Kromozom hazırlama ve karyotip analizi
<ol><li>Yabani tip ve CENP-E-/- HeLa hücrelerini, 24 saat boyunca% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş tam DMEM ortamında kültürleyin ve daha sonra, vahşi tip ve CENP-E-/- HeLa hücrelerini 5 saat boyunca 300 nM kolşisin ile inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri %0.25 tripsin/EDTA ile 37 °C'de 3 dakika inkübe edin ve hücreleri 1.5 mL santrifüj tüplerinde toplayın.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, süpernatanları atın, 1.2 mL 0.075 mol / L KCl çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, süpernatanları atın, ön fiksasyon için 0.2 mL fiksatif çözelti (metanol: buzlu asetik asit = 3: 1) ekleyin ve 1 dakika boyunca hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, peletleri toplayın, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.5 mL fiksatif çözelti ekleyin ve ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanları atın, 0.6 mL fiksatif çözelti ekleyin ve bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Buz kaydıraklarının üzerine 35-40 cm yükseklikten 3-5 damla hücre süspansiyonu ekleyin. NOT: Hücre süspansiyonlarını kızaklara bırakmak için yüksekliği 35-40 cm'de tutun; Aksi takdirde, kromozomlar çok dağınık olabilir veya birbirinden ayrılmayabilir.</li>
	<li>Slaytları hemen bir alkol lambası ile kurulayın, numuneleri %10 Giemsa boyama solüsyonu ile 7 dakika boyayın, slaytları 2 dakika akan su ile durulayın ve Plan Fluor 40x/NA 0.75 objektif ile donatılmış bir ışık mikroskobu kullanarak numuneleri gözlemleyin.</li>
</ol>5. Hücre kolonisi oluşum testi
<ol><li>Hücre süspansiyonlarını 6 oyuklu plakalarda 1.000-2.000 hücre/kuyu hücre yoğunluğunda hazırlayın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın.</li>
	<li>6 oyuklu plakaları bir CO2 inkübatörüne yerleştirin ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de 2-3 hafta inkübe edin. Kültür ortamını her 5 günde bir değiştirin. 10x ve 20x objektif lenslerle donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görüntüleri kaydedin. Koloniler göründüğünde hücreleri hasat edin (bir klon içindeki yüzlerce hücre).</li>
	<li>GSK923295 etkilerini incelemek için, hücreleri 6 oyuklu plakalarda 24 saat boyunca kültürleyin ve 10, 25, 50, 100 ve 200 nM'lik son konsantrasyonlarda 2 mL GSK923295 ekleyin. NOT: Yeni klonlar oluşturabilecek ve transfekte edilmiş hücrelerin taranmasını etkileyebilecek hücre dökülmesini önlemek için kültür kabını klon oluşumunun erken aşamasında hareket ettirmeyin.</li>
	<li>Kültür ortamını atın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1 PFA ile sabitleyin. Kolonileri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0.1 kristal viyole boyama solüsyonu ile boyayın. Numuneleri 1x PBS ile üç kez durulayın. ImageJ yazılımını kullanarak hücre kolonilerinin görüntülerini kaydedin ve her koloninin çaplarını ölçün. Düz çizgi seçim aracını seçin, Analiz Et'e tıklayın, Ölç'ü seçin ve uzunluğu kaydedin.</li>
	<li>Kolonileri 1 mL% 10 asetik asit çözeltisi ile 5 dakika durulayın. 200 μL'lik süpernatan çözeltileri 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve A600 nm'de bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak absorbans değerlerini ölçün.</li>
</ol>6. Hücre canlılığı testi
<ol><li>Hücreleri 24 oyuklu plakalara tohumlayın ve hücreleri 48 saat ila% 80-90 yoğunlukta kültürleyin.</li>
	<li>Hücreleri 100 μL% 0.25 tripsin / EDTA ile 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.</li>
	<li>400 μL PBS'yi bir pipet tabancası ile hücrelerle karıştırın. 100 μL hücre süspansiyonunu 96 oyuklu plakaya aktarın.</li>
	<li>Her bir oyuğa 317 μg/mL nihai konsantrasyona sahip 20 μL MTS çözeltisi ekleyin ve üreticinin protokollerine göre hafifçe karıştırın. Numuneleri bir CO2 inkübatöründe 1-3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak her bir kuyucuğun absorbans değerlerini A490 nm'lik absorbans zirvesinde kaydedin. Hücre kalıntısı ve spesifik olmayan absorbansın katkıda bulunduğu arka planı çıkarmak için A630 nm'lik bir referans dalga boyu kullanın (Hücre canlılığı = A490nm- A630 nm).</li>
</ol>

CRISPR/Cas9 Sistemi Kullanılarak Sentromerle İlişkili Protein-E Gen Düzenlemesi

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Kinesin-7 CENP-E, hücre bölünmesi 17,19,20 sırasında kromozom hizalamasında ve iğ montaj kontrol noktasında önemli bir düzenleyicidir. CENP-E'nin genetik silinmesi genellikle iğ montaj kontrol noktasının aktivasyonu, hücre döngüsü durması ve hücre ölümü ile sonuçlanır 27,29,51,52.</su...

Tasarlanmış genom düzenleme, çeşitli hücrelerde ve organizmalarda genlerin hedeflenen modifikasyonlarına aracılık eder. Ökaryotlarda, bölgeye özgü mutajenez, hedef DNA1'in homolog rekombinasyonunu uyaran diziye özgü nükleazların uygulanmasıyla tanıtılabilir. Son yıllarda, çinko parmak nükleazları (ZFN'ler)2,3, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN'ler)4,5 ve güdümlü meganükleazlar 6,7 dahil olmak üzere çeşitli genom düzenleme teknolojileri, genomları belirli bölgelerde parçalamak için tasarlanmıştır, ancak bu yaklaşımlar karmaşık protein mühendisliği ve gereksiz deneysel prosedürler gerektirir. Çalışmalar, tip II prokaryotik kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/Cas sisteminin, çok çeşitli hücrelerde ve türlerdeRNA kılavuzlu, bölgeye özgü DNA bölünmesine spesifik olarak aracılık eden verimli bir gen düzenleme teknolojisi olduğunu göstermiştir 8,9,10,11. CRISPR/Cas9 gen nakavt teknolojisi, temel biyoloji, biyoteknoloji ve tıp alanlarında devrim yarattı12.
Bakteriler ve çoğu arke, virüsleri ve plazmitleri tanımlamak ve yok etmek için CRISPR ve Cas proteinlerini kullanan RNA tabanlı bir adaptif bağışıklık sistemi geliştirmiştir13. Streptokok pyogenes Cas9 (SpCas9) endonükleaz, CRISPR RNA'ları (crRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA) içeren sentetik bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sağlayarak diziye özgü, çift sarmallı kırılmalara (DSB'ler) verimli bir şekilde aracılık edebilen RuvC benzeri Holliday bağlantı resolvazı (RuvC) ve His-Asn-His (HNH) alanını içerir14,15,16. DSB'ler, memeli hücrelerinde insersiyonlar, delesyonlar veya yara izi olmayan tek nükleotid ikameleri dahil olmak üzere çoklu mutasyonları ortaya çıkaran indel oluşturan homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu ile onarılabilir 1,8. Hem hataya eğilimli NHEJ hem de yüksek kaliteli HDR yolu, çerçeve kayması mutasyonlarına ve erken durdurma kodonlarına neden olabilen eklemeler veya silmeler yoluyla gen nakavtına aracılık etmek için kullanılabilir10.
Kinesin-7 CENP-E, hücre bölünmesi sırasında kinetokor-mikrotübül bağlanması ve kromozom hizalaması için gereklidir 17,18,19. CENP-E'nin antikor mikroenjeksiyonu20,21, siRNA tükenmesi22,23, kimyasal inhibisyon 24,25,26 ve genetik delesyon 27,28,29, kromozom yanlış hizalanmasına, iğ montaj kontrol noktasının aktivasyonuna ve mitotik defektlere yol açar, bu da anöploidi ve kromozomal instabilite ile sonuçlanır19,30. Farelerde, CENP-E delesyonu, gelişimin çok erken aşamalarında anormal gelişim ve embriyonik ölümcüllük ile sonuçlanır 27,29,31. CENP-E'nin genetik silinmesi genellikle kromozomun yanlış hizalanmasına ve hücre ölümüne yol açar 26,27,29, bu da CENP-E proteinlerinin işlevlerini ve mekanizmalarını incelemede bir engeldir.
Yakın zamanda yapılan bir çalışma, CENP-E proteinlerinin nispeten kısa sürede hızlı bir şekilde parçalanmasını sağlayan bir Auxin ile indüklenebilir CRISPR / Cas9 gen düzenleme yöntemi32 kullanarak koşullu bir CENP-E nakavt hücre hattı oluşturmuştur33. Bununla birlikte, bugüne kadar, CENP-E biyolojisinde çözülmemiş bir teknik zorluk olan kararlı CENP-E nakavt hücre hatları kurulmamıştır. CENP-E'nin tamamen silinmesinin doğrudan sonuçları karmaşık ve öngörülemez olabileceğinden, genetik sağlamlık34, genetik kompanzasyon yanıtları 35,36,37 ve karmaşık hücre içi ortamlar göz önüne alındığında, kromozom hizalama mekanizmalarının araştırılması için CENP-E nakavt hücre hatlarının oluşturulması önemlidir.
CENP-E inhibitörlerinin keşfi ve uygulamaları kanser tedavisi için önemlidir. Bugüne kadar, GSK923295 ve türevleri24,25, PF-277138,39, imidazo [1,2-a] piridin iskele türevleri40,41, bileşik-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 ve benzo [d] pirolo [2,1-b] tiazol türevleri47 dahil olmak üzere yedi tip CENP-E inhibitörü bulunmuş ve sentezlenmiştir. Bu inhibitörler arasında GSK923295, CENP-E'nin motor alanına bağlanan ve CENP-E mikrotübül ile uyarılan ATPaz aktivitesini 3.2 ila 0.2 nM24,25'lik bir Ki ile inhibe eden allosterik ± etkili bir CENP-E inhibitörüdür. Bununla birlikte, GSK923295'nin kültürlenmiş kanser hücreleri üzerindeki inhibitör etkileri ile karşılaştırıldığında, klinik kanser hastalarında GSK923295 terapötik etkileri ideal değildir48,49, bu da CENP-E için GSK923295 özgüllüğü konusunda endişeleri artırmıştır. Ayrıca, diğer CENP-E inhibitörlerinin CENP-E proteinleri üzerindeki özgüllüğü ve yan etkileri, kanser araştırmalarında kilit konulardır.
Bu çalışmada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak HeLa hücrelerindeki CENP-E genini tamamen devre dışı bıraktık. CENP-E gen düzenlemesinin tarama verimliliğini ve başarı oranını artırmak için hücre kolonisi taraması, kromozom hizalama fenotipleri ve CENP-E proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere optimize edilmiş üç fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur. Ayrıca, CENP-E nakavt hücre hatları, CENP-E için aday bileşiklerin özgüllüğünü test etmek için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4S Gelred, 10,000x in water</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>A616697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10000218</td>
			<td>Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>A620014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0428</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0423</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0460</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>100092690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab254326</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-376392</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133583</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting medium</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Slowing down the quenching of fluorescent signals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-tubulin mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7291</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek Instruments</td>
			<td>Biotek Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>69003435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424BK745380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>61001563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80344-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent cells</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B528413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL2000 DNA marker</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free plasmid mini kit <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65476/65476eq02.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B518251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Zhejiang Tianhang Biotechnology</td>
			<td>11011-8611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentian violet</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>71019944</td>
			<td>Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa staining solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>71020260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 8.0 software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>www.graphpad.com</td>
			<td>Statistical analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK923295</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Heal Force</td>
			<td>HF90/HF240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>Image processing and analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nanjing Jiangnan Novel Optics</td>
			<td>XD-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>A507003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipo6000 transfection reagent</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-S2 microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#160;reduced&#160;serum&#160;medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80096618</td>
			<td>Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep column DNA gel extraction kit</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B518131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep&#160;column&#160;plasmid&#160;mini-preps&#160;kit</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B518191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30188928</td>
			<td>Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30189328</td>
			<td>Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of centromere-associated protein-e cenp-e-/- knockout cell lines using the crispr/cas9 system

CRISPR (kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar) / Cas9 sistemi, çeşitli organizmalarda hassas ve verimli gen düzenleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Sentromer ile ilişkili protein-E (CENP-E), kinetokor-mikrotübül yakalama, kromozom hizalaması ve mil montaj kontrol noktası için gerekli olan artı uca yönelik bir kinesindir. CENP-E proteinlerinin hücresel fonksiyonları iyi çalışılmış olmasına rağmen, CENP-E proteinlerinin doğrudan fonksiyonlarını geleneksel protokoller kullanarak incelemek zor olmuştur çünkü CENP-E ablasyonu genellikle iğ montaj kontrol noktası aktivasyonuna, hücre döngüsü durmasına ve hücre ölümüne yol açar. Bu çalışmada, insan HeLa hücrelerindeki CENP-E genini tamamen devre dışı bıraktık ve CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak CENP-E-/- HeLa hücrelerini başarıyla ürettik.
Hücre kolonisi taraması, kromozom hizalama fenotipleri ve CENP-E proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere, CENP-E nakavt hücrelerinin tarama verimliliğini ve deneysel başarı oranını etkili bir şekilde artıran üç optimize edilmiş fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur. Önemli olarak, CENP-E delesyonu, kromozomun yanlış hizalanmasına, BUB1 mitotik kontrol noktası serin / treonin kinaz B (BubR1) proteinlerinin anormal konumuna ve mitotik kusurlara neden olur. Ayrıca, CENP-E'ye özgü inhibitörler için bir tanımlama yöntemi geliştirmek için CENP-E nakavt HeLa hücre modelini kullandık.
Bu çalışmada, CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yararlı bir yaklaşım oluşturulmuştur. Ayrıca, bu makale, hücre bölünmesinde CENP-E mekanizmalarını araştırmak için güçlü bir araç olabilecek CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak CENP-E gen düzenleme protokollerini sunmaktadır. Ayrıca, CENP-E nakavt hücre hattı, antitümör ilaç geliştirme, hücre biyolojisinde hücre bölünme mekanizmaları çalışmaları ve klinik uygulamalar için önemli etkileri olan CENP-E inhibitörlerinin keşfine ve doğrulanmasına katkıda bulunacaktır.

Engineered genome editing mediates the targeted modifications of genes in a variety of cells and organisms. In eukaryotes, site-specific mutagenesis can be introduced by the applications of sequence-specific nucleases that stimulate homologous recombination of target DNA1. In recent years, several genome editing technologies, including zinc finger nucleases (ZFNs)2,3, transcription activator-like effector nucleases (TALENs)4,5, and homing meganucleases6,7, have been engineered to cleave genomes at specific sites, but these approaches require complex protein engineering and redundant experimental procedures. Studies have shown that the type II prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas system is an efficient gene editing technology, which specifically mediates RNA-guided, site-specific DNA cleavage in a wide variety of cells and species8,9,10,11. The CRISPR/Cas9 gene knockout technology has revolutionized the fields of basic biology, biotechnology, and medicine12.
Bacteria and most archaea have evolved an RNA-based adaptive immune system that uses CRISPR and Cas proteins to identify and destroy viruses and plasmids13. Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) endonuclease contains the RuvC-like Holliday junction resolvase (RuvC) and His-Asn-His (HNH) domain, which can efficiently mediate sequence-specific, double-stranded breaks (DSBs) by providing a synthetic single-guide RNA (sgRNA) containing CRISPR RNAs (crRNA) and trans-activating crRNA (tracrRNA)14,15,16. DSBs can be repaired through the indel-forming non-homologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) pathway, which introduces multiple mutations, including insertions, deletions, or scar-less single nucleotide substitutions, in mammalian cells1,8. Both the error-prone NHEJ and the high-fidelity HDR pathway can be used to mediate gene knockout through insertions or deletions, which can cause frameshift mutations and premature stop codons10.
Kinesin-7 CENP-E is required for kinetochore-microtubule attachment and chromosome alignment during cell division17,18,19. Antibody microinjection20,21, siRNA depletion22,23, chemical inhibition24,25,26, and genetic deletion27,28,29 of CENP-E leads to chromosome misalignment, the activation of spindle assembly checkpoint and mitotic defects, which results in aneuploidy and chromosomal instability19,30. In mice, CENP-E deletion results in abnormal development and embryonic lethality at the very early stages of development27,29,31. Genetic deletion of CENP-E usually leads to chromosome misalignment and cell death26,27,29, which is an obstacle in studying the functions and mechanisms of the CENP-E proteins.
A recent study has established a conditional CENP-E knockout cell line using an Auxin-inducible CRISPR/Cas9 gene-editing method32, which enables rapid degradation of CENP-E proteins in a relatively short time33. However, to date, stable CENP-E knockout cell lines have not been established, which is an unresolved technical challenge in CENP-E biology. Considering genetic robustness34, genetic compensation responses35,36,37, and complex intracellular environments, as the direct consequences of complete deletion of CENP-E may be complex and unpredictable, it is important to establish CENP-E knockout cell lines for the investigation of mechanisms of chromosome alignment, spindle assembly checkpoint, and downstream signaling pathways.
The discovery and applications of CENP-E inhibitors are important for cancer treatment. To date, seven types of CENP-E inhibitors have been found and synthesized, including GSK923295 and its derivatives24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]pyridine scaffold derivatives40,41, compound-A42,43, syntelin44,45, UA6278446, and benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives47. Among these inhibitors, GSK923295 is an allosteric and efficient CENP-E inhibitor that binds to the motor domain of CENP-E and inhibits CENP-E microtubule-stimulated ATPase activity with a Ki of 3.2 &#177; 0.2 nM24,25. However, compared with the inhibitory effects of GSK923295 on cultured cancer cells, the therapeutic effects of GSK923295 in clinical cancer patients are not ideal48,49, which also raised concerns about the specificity of GSK923295 for CENP-E. Moreover, the specificity and side effects of other CENP-E inhibitors on the CENP-E proteins are key issues in cancer research.
In this study, we have completely knocked out the CENP-E gene in HeLa cells using the CRISPR/Cas9 system. Three optimized phenotype-based screening strategies have been established, including cell colony screening, chromosome alignment phenotypes, and the fluorescent intensities of CENP-E proteins, to improve the screening efficiency and success rate of CENP-E gene editing. Furthermore, CENP-E knockout cell lines can be used to test the specificity of candidate compounds for CENP-E.

Yazar Spot Işığı: CENP-E Nakavt HeLa Hücrelerinin Kurulması - Kinesin-7 CENP-E Biyolojisi ve İnhibitörlerini İncelemek İçin Yeni Bir Yaklaşım

CRISPR/Cas9 Sistemini Kullanarak Sentromerle İlişkili Protein-E CENP-E-/- Nakavt Hücre Hatlarının Üretilmesi

Genetic deletion of Kinesin-7 and CENP usually results in cell cycle arrest and cell death. The construction of stable CENP knockout cell lines is an important unresolved issue in CENP biology. In this study, we generated CENP knockout HeLa cells using a CRISPR/Cas9 system, and established three optimized screening strategies.Recently, several genome editing technologies, including zinc-finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and how we make our nucleases, has been engineered to cleave genomes at a specific size. The CRISPR/Cas9 gene knockout technology has revolutionized basic biology, biotechnology, and medicine. CENP is essential for attaching kinetochores to microtubules and aligning chromosomes.Disrupting CENP, whether through antibody microinjection, sgRNA deletion, chemical inhibition, or genetic deletion, result in chromosome misalignment, mitotic defects, and often cell death, complicating the study of CENP protein mechanisms. In this study, three optimized phenotype-based screening strategies were established, including cell colony screening, chromosome alignment of phenotypes, and the fluorescent intensities of CENP proteins, which improved the screening efficiency and the experimental success rate. Importantly, CENP deletion results in chromosome misalignment, the abnormal location of BubR1 proteins, and mitotic defects.The interaction modes and the molecular mechanisms of CENP and its inhibitors are important research fields in cell biology and cancer research. In this study, the CENP knockout HeLa cell line has been established as a valuable tool for the validation of the specificity and the toxicity of CENP inhibitors.

CENP-E-/- HeLa hücreleri, CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak başarıyla üretildi (Şekil 1). Bu yöntemin zaman çizelgesi ve kritik deneysel adımları Şekil 1'de gösterilmektedir. İlk olarak, CENP-E'ye özgü sgRNA'ları tasarladık ve sentezledik, sgRNA'ları tavladık ve pX458 plazmidine bağladık, plazmiti HeLa hücrelerine transfekte ettik ve 48 saat boyunca kültürledik. Transfekte edilen hücreler ayrıştırıldı ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System at JoVE.com

Bu makale, CRISPR/Cas9 sistemi ve üç fenotip tabanlı tarama stratejisi kullanılarak sentromerle ilişkili protein-E (CENP-E) nakavt hücrelerinin yapımını bildirmektedir. İlaç geliştirme ve biyolojik araştırmalar için yararlı olan CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yeni bir yaklaşım oluşturmak için CENP-E nakavt hücre hattını kullandık.

The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 system has emerged as a powerful tool for precise and efficient gene editing ...

Kinesin-7 ve CENP'nin genetik silinmesi genellikle hücre döngüsünün durması ve hücre ölümü ile sonuçlanır. Kararlı CENP nakavt hücre hatlarının inşası, CENP biyolojisinde çözülmemiş önemli bir konudur. Bu çalışmada, bir CRISPR / Cas9 sistemi kullanarak CENP nakavt HeLa hücreleri oluşturduk ve optimize edilmiş üç tarama stratejisi oluşturduk.Son zamanlarda, çinko parmak nükleazları, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar ve nükleazlarımızı nasıl yaptığımız dahil olmak üzere çeşitli genom düzenleme teknolojileri, genomları belirli bir boyutta parçalamak için tasarlanmıştır. CRISPR/Cas9 gen nakavt teknolojisi, temel biyoloji, biyoteknoloji ve tıpta devrim yarattı. CENP, kinetokorları mikrotübüllere bağlamak ve kromozomları hizalamak için gereklidir.Antikor mikroenjeksiyonu, sgRNA delesyonu, kimyasal inhibisyon veya genetik delesyon yoluyla CENP'nin bozulması, kromozomun yanlış hizalanmasına, mitotik kusurlara ve sıklıkla hücre ölümüne neden olarak CENP protein mekanizmalarının incelenmesini zorlaştırır. Bu çalışmada, hücre kolonisi taraması, fenotiplerin kromozom hizalaması ve CENP proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere üç optimize edilmiş fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur, bu da tarama verimliliğini ve deneysel başarı oranını artırmıştır. Daha da önemlisi, CENP silinmesi kromozomun yanlış hizalanmasına, BubR1 proteinlerinin anormal konumuna ve mitotik kusurlara neden olur.CENP ve inhibitörlerinin etkileşim modları ve moleküler mekanizmaları, hücre biyolojisi ve kanser araştırmalarında önemli araştırma alanlarıdır. Bu çalışmada, CENP nakavt HeLa hücre hattı, CENP inhibitörlerinin özgüllüğünün ve toksisitesinin doğrulanması için değerli bir araç olarak kurulmuştur.

generation-centromere-associated-protein-e-cenp-e-knockout-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System

396 Görüntüleme.  Fujian Medical University. Kinesin-7 ve CENP'nin genetik silinmesi genellikle hücre döngüsünün durması ve hücre ölümü ile sonuçlanır. Kararlı CENP nakavt hücre hatlarının inşası, CENP biyolojisinde çözülmemiş önemli bir konudur. Bu çalışmada, bir CRISPR / Cas9 sistemi kullanarak CENP nakavt HeLa hücreleri oluşturduk ve optimize edilmiş üç tarama stratejisi oluşturduk.Son zamanlarda, çinko parmak nükleazları, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar ve nükleazla...