Erzeugung von Zentromer-assoziierten Protein-E CENP-E^-/- Knockout-Zelllinien mit dem CRISPR/Cas9-System

Die genetische Deletion von Kinesin-7 und CENP führt in der Regel zu einem Zellzyklusstillstand und Zelltod. Die Konstruktion stabiler CENP-Knockout-Zelllinien ist ein wichtiges ungelöstes Problem in der CENP-Biologie. In dieser Studie erzeugten wir CENP-Knockout-HeLa-Zellen mit einem CRISPR/Cas9-System und etablierten drei optimierte Screening-Strategien.

In jüngster Zeit wurden mehrere Genom-Editing-Technologien, darunter Zinkfinger-Nukleasen, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen und die Art und Weise, wie wir unsere Nukleasen herstellen, entwickelt, um Genome bei einer bestimmten Größe zu spalten. Die CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Technologie hat die Grundlagenbiologie, Biotechnologie und Medizin revolutioniert. CENP ist unerlässlich, um Kinetochore an Mikrotubuli zu binden und Chromosomen auszurichten.

Die Störung von CENP, sei es durch Antikörper-Mikroinjektion, sgRNA-Deletion, chemische Hemmung oder genetische Deletion, führt zu Chromosomenfehlstellungen, mitotischen Defekten und oft zum Zelltod, was die Untersuchung der CENP-Proteinmechanismen erschwert. In dieser Studie wurden drei optimierte phänotypbasierte Screening-Strategien etabliert, darunter das Screening von Zellkolonien, die Chromosomenausrichtung von Phänotypen und die Fluoreszenzintensitäten von CENP-Proteinen, die die Screening-Effizienz und die experimentelle Erfolgsrate verbesserten. Wichtig ist, dass die CENP-Deletion zu einer Fehlausrichtung der Chromosomen, der abnormalen Position von BubR1-Proteinen und mitotischen Defekten führt.

Die Interaktionsmodi und die molekularen Mechanismen von CENP und seinen Inhibitoren sind wichtige Forschungsfelder in der Zellbiologie und Krebsforschung. In dieser Studie wurde die CENP-Knockout-HeLa-Zelllinie als wertvolles Werkzeug zur Validierung der Spezifität und der Toxizität von CENP-Inhibitoren etabliert.