Este protocolo permite el desarrollo de la eliminación de células musculares en cualquier gen, con el fin de estudiar más a fondo la función de este gen en el músculo. La ventaja es que es barato y más rápido que el desarrollo de animales knock-out para estudiar cualquier gen. Esta técnica se puede utilizar, por ejemplo, para estudiar la implicación de un gen recién identificado en una miopatía.
Si la técnica descrita aquí se aplica a las células iPS, puede conducir al desarrollo de células knock-out para cualquier gen en cualquier tipo de células. Para comenzar a agrupar repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas o la deleción de genes mediada por CRISPR, primero use herramientas de navegador del genoma como ensembl. org para identificar el gen objetivo junto con las secuencias de ADN en ambos lados del mismo.
Para obtener la lista de los exones genéticos, primero haga clic en la transcripción de la secuencia codificante de proteínas y luego en Exones. A continuación, haga clic en Descargar secuencia y seleccione solo Secuencia genómica para descargar la secuencia de consenso completa de todo el gen. Desplácese por la lista de los exones e intrones del gen para seleccionar los dirigidos.
Para diseñar el ARN guía, primero seleccione las secuencias de nucleótidos de los intrones inmediatamente aguas arriba y aguas abajo de la secuencia objetivo. Luego vaya a un sitio web como crispr.tefor. net y use las secuencias seleccionadas para diseñar dos ARN guía, cada uno de 20 nucleótidos de largo sin el Motivo Adyacente protoespaciador separado por unos pocos cientos de pares de bases.
A continuación, determine la secuencia inversa del complemento para cada ARN guía y ordene los cebadores. Para construir casetes de ARN guía para la clonación de plásmidos, primero ejecute una PCR con un conjunto de cebadores utilizando la receta y el programa descritos en el texto, luego separe los productos de PCR en gel de agarosa al 1% utilizando el tampón Tris-borate-EDTA. A continuación, elimine el fragmento del par de 300 bases y purifique con un kit.
Del mismo modo, después de ejecutar otra PCR con el otro conjunto de imprimación, purifique un fragmento de ADN largo de 400 pares de bases en 20 microlitros de tampón de elución. Para insertar los casetes de ARN guía en una columna vertebral de plásmido lentiviral, primero configure una reacción de doble digestión del plásmido con las enzimas de restricción Xma 1 y Blp 1 como se describe en el texto. Después de incubar el tubo de reacción a 37 grados Celsius durante una hora, incube a 65 grados Celsius durante 20 minutos, luego ejecute el producto de digestión en un gel de agarosa al 1% y purifique el plásmido de aproximadamente 10 pares de kilobases utilizando un kit apropiado.
También cuantificar el producto purificado midiendo la densidad óptica. Para ligar el casete de ARN guía con el plásmido, prepare una mezcla de reacción con el ARN guía purificado, el ADN plásmido linealizado, la enzima y el agua a un volumen final de 10 microlitros, luego incube el tubo de reacción a 50 grados Celsius durante 15 minutos para generar el plásmido final, llamado pGuide. Para la producción de lentivirus, primero sembra una placa de 145 centímetros con 1 millón de células HEK 293 en DMEM con alta glucosa y piruvato suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina o estreptomicina.
Luego cultive las células a 37 grados Celsius durante tres días en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Al cuarto día, verifique las células para garantizar una confluencia del 60 al 65%. A continuación, prepare la solución de transfección que consiste en el plásmido de interés, el plásmido que codifica la envoltura del virus, el plásmido de empaque lentiviral psPAX2 y el fosfato de calcio.
Ajuste el volumen final a 1000 microlitros con agua. A continuación, agregue la solución de transfección gota a gota a un mililitro de 2X HBS bajo agitación e incube a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos. Después de eso, agregue la solución gota a gota a las celdas.
Para una distribución homogénea de la solución de transfección, incline suavemente la placa en todas las direcciones, luego incube las células a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante al menos cinco horas. A continuación, retire los medios de las placas y lave las células con PBS para deshacerse de los reactivos de transfección, luego agregue 12 mililitros de medio fresco. Después de 48 horas de incubación a 37 grados centígrados, agrupe los medios de todas las placas en un tubo.
Coloque el tubo en un cucharón sellado y centrífuga a 800 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, luego filtre el sobrenadante usando un filtro de 0.45 micrómetros y centrífique el filtrado a 68, 300 veces G durante dos horas a cuatro grados Celsius, usando un rotor de cucharón oscilante. Después de retirar el sobrenadante, mantenga los tubos boca abajo en una toalla de papel en un gabinete de seguridad durante cinco a 10 minutos para la máxima eliminación del líquido de los gránulos. Agregue 100 microlitros de medio de proliferación de HEC y mantenga los tubos a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas.
Luego vuelva a suspender el pellet mediante pipeteo. Después de recolectar todos los gránulos resuspendidos, haga alícuotas de 10 o 25 microlitros, luego almacene las alícuotas a menos 80 grados Celsius después de la congelación instantánea en hidrógeno líquido. Para la transducción de mioblastos, primero sembra cada pocillo de una placa de 96 pocillos con 100 microlitros de medio de proliferación que contiene 10, 000 células de mioblastos.
Al día siguiente, agregue volúmenes precalculados de guías LV y LV Cas9 a las celdas en un gabinete de seguridad. Después de cinco días de incubación, libere las células del pozo agregando tripsina. Después de contar los números de células, transfiera las células de los pozos con 40 a 50% de confluencia a una nueva placa.
Después de cinco horas de incubación, agregue volúmenes calculados de LV killer a una multiplicidad de infección de 20 e incube durante cinco a 10 días o al menos dos pasajes intermedios. Para la caracterización funcional de los clones editados genéticamente por imágenes de calcio, placa 50, 000 células en el centro de un plato de 35 milímetros recubierto de laminina. Para inducir la diferenciación, agregue el medio de diferenciación como se describe en el texto.
Después de seis días de incubación, retire el medio de cultivo y delinee las células con una pluma hidrofóbica. Luego agregue 50 microlitros de Fluo-4 Direct, diluidos uno a uno en medio de diferenciación, a los miotubos diferenciados. Después de incubar los platos a 37 grados centígrados durante 30 minutos, lave las células dos veces con el tampón Krebs complementado con un miligramo por mililitro de glucosa.
A continuación, use un microscopio de fluorescencia invertida o un microscopio confocal con un objetivo 10X para medir las variaciones de fluorescencia a una velocidad de un cuadro por segundo durante 90 segundos y elija un campo con al menos 10 miotubos. Después de eliminar el tampón Krebs adicional, estimule las células con dos mililitros de cloruro de potasio para la despolarización de la membrana o dos mililitros de metacresol florocloral o estimulación directa 4CmC o RyR1. Visualice la variación de fluorescencia después de la estimulación, luego cuantifique la variación de fluorescencia en cada miotubo.
Este protocolo podría usarse con éxito para eliminar el gen RyR1 de los mioblastos humanos, lo que resultó en un ADN genómico más corto en las células. El knock-out de RyR1 también se confirmó a nivel de proteína, ya que la proteína RyR1 no pudo ser detectada en las células objetivo por Western blotting. La ausencia de actividad de RyR1 en los miotubos diferenciados de las células knock-out de RyR1 se verificó aún más mediante imágenes de calcio Fluo-4 después de la estimulación directa de RyR1 por 4CmC o la estimulación indirecta por la despolarización de la membrana inducida por cloruro de potasio.
La secuencia que se eliminará debe ser necesaria para la predicción de una proteína funcional. Esta técnica es ideal para el desarrollo de herramientas post-genómicas para estudiar la implicación de nuevos genes en la enfermedad muscular.
