Para empezar, tome una placa de células HeLa de tipo salvaje y mutantes CENP-E que crecen en un cubreobjetos. Fije las células con paraformaldehído al 4% y solución fijadora de PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, sumérgete en PBS durante dos rondas de cinco minutos cada una.
A continuación, permeabilice las células con Triton X-100 al 0,25% y PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Sumérgelos en PBS durante dos rondas de cinco minutos cada una. Proceda a bloquear las celdas con 1%BSA PBS con 0.1%Tween 20 a temperatura ambiente durante una hora.
Diluir los anticuerpos primarios en BSA y PBST al 1% e incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante 12 horas. Deseche las soluciones primarias de anticuerpos. Luego, enjuague las células tres veces durante cinco minutos cada una con PBS.
Agregue anticuerpos secundarios diluidos a la célula e incube a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, deseche los anticuerpos secundarios. A continuación, enjuague las células con PBS tres veces durante cinco minutos cada una.
Tiñe los núcleos con DAPI a temperatura ambiente durante cinco minutos. Monta las guías con el medio de montaje y séllalas con esmalte de uñas. Observe las imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio confocal de barrido, equipado con un objetivo de apertura numérica de 1,40 aumentos de 63 aumentos, y regístrelas para su posterior análisis.
La tinción por inmunofluorescencia de los grupos control y mutante CENP-E mostró que las intensidades de fluorescencia de las proteínas CENP-E se eliminaron por completo en las células del clon 1 mutante de CENP-E y disminuyeron significativamente en las células del clon 3 del mutante CENP-E. Las proporciones de células metafásicas con desalineación cromosómica aumentaron en los clones 1 y 3 en comparación con las células control. Mientras tanto, las proporciones de células metafásicas aumentaron significativamente en las células Clon 1 y Clon 3.
Además, la proporción de células de interfase aumentó ligeramente en los grupos de clones 1 y 3 después de la deleción de CENP-E, en comparación con el grupo de control. Las tasas de células de profase, anafase y telofase disminuyeron ligeramente después de la deleción de CENP-E, mientras que las tasas de células de metafase aumentaron después de la deleción de CENP-E.
