Preparación cromosómica y análisis del cariotipo de células HeLa knockout de CENP-E mediadas por CRISPR/Cas9

Para empezar, tome los cultivos celulares HeLa de tipo salvaje y mutante CENP-E y agregue 300 colchicina nanomolar antes de incubarlos durante cinco horas. A continuación, incube las células con tripsina-EDTA al 0,25% a 37 grados centígrados durante tres minutos y recoja las células en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, centrifugar las células a 1000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente, desechar los sobrenadantes y añadir 1,2 mililitros de solución de cloruro de potasio 0,075 molar.

Incubar las células a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Al final de la incubación, centrifugar las células, desechar el sobrenadante y agregar 0,2 mililitros de solución fijadora para el prefijo. Mezcle suavemente durante un minuto, luego recoja los gránulos celulares como se demostró anteriormente y agregue 1,5 mililitros de solución fijadora a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Después de centrifugar las células y desechar el sobrenadante, agregue 0,6 mililitros de las soluciones fijadoras para crear una suspensión celular. Deje caer con cuidado de tres a cinco gotas de las suspensiones celulares de 35 a 40 centímetros sobre los toboganes de hielo. Seque inmediatamente los portaobjetos con una lámpara de alcohol y tiña con la solución de sostenedor de Giemsa al 10% durante siete minutos.

Enjuague los portaobjetos con agua corriente durante dos minutos, luego examine las muestras con un microscopio óptico equipado con un objetivo de apertura numérica de 0,75 aumentos Plan Fluor 40 veces. El análisis del cariotipo reveló una disminución del número de cromosomas en las células HeLa mutantes de CENP-E en comparación con las células de tipo salvaje.