Para comenzar el análisis de citometría de flujo, primero configure el láser de 785 nanómetros a una potencia de cinco milivatios para mediciones de campo oscuro. Utilice un objetivo de 60X con una apertura numérica de 0,9. A continuación, seleccione el ajuste de alta sensibilidad y ajuste la velocidad a baja.
Para garantizar la estabilidad del cordón de calibración, presione el botón Reproducir en la caja de fluidos y examine las imágenes del cordón, que deben aparecer nítidas y claras. Genere un nuevo diagrama de dispersión en el cuadro del espacio de trabajo seleccionando Nuevo diagrama de dispersión. A continuación, seleccione el área en el canal de campo claro que corresponda a la intensidad del canal SSC y excluya los cordones de calibración que se ejecutan simultáneamente dentro de la muestra.
A continuación, presione el botón Cargar y coloque un tubo que contenga la muestra de lactobacilos en el soporte. En el cuadro Configuración de adquisición, escriba el nombre de la muestra y especifique la ubicación para el almacenamiento de datos. Establezca el número de eventos que se van a recopilar, normalmente dentro del intervalo de 10.000 a 20.000 eventos.
Ahora, comience el proceso de adquisición haciendo clic en el botón Grabar ubicado en el cuadro Adquisición. El proceso se detendrá después de alcanzar el volumen especificado de eventos. Presione el botón Return para descargar el tubo y retírelo del soporte como se le solicite en la ventana emergente.
Después de repetir el proceso para todas las muestras, guarde la plantilla para mantener la uniformidad de la adquisición de datos. Para el análisis de datos, para cargar el archivo sin procesar en el software de análisis, haga clic en Archivo y abra el archivo rif. En la ventana abierta, seleccione Usar análisis de adquisición y, a continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, para crear un histograma de la raíz cuadrada media del gradiente, haga clic en el botón Nuevo histograma y elija la población de la adquisición que desea analizar.
En la función Eje X, seleccione Gradiente RMS del canal de campo claro. A continuación, coloque una puerta para excluir eventos no enfocados haciendo clic en el botón Crear región de línea en el área de análisis. Cree un diagrama de dispersión del área frente a la relación de aspecto haciendo clic en el botón Nuevo diagrama de dispersión en el área de análisis.
Seleccione la población seleccionada en la ventana Nuevo diagrama de dispersión. A continuación, seleccione el área del canal de campo claro para la función Eje X. Elija la relación de aspecto para la función Eje Y.
Dibuje una puerta en el diagrama de dispersión con el botón Crear rectángulo en función del valor del área para la población de eventos agregados. Del mismo modo, dibuje otra puerta para la población soltera y de pequeños agregados. Guarde el análisis de datos como una plantilla haciendo clic en la pestaña Archivo, eligiendo Guardar como plantilla ast y, a continuación, abra el siguiente archivo de ejemplo con la misma plantilla para crear el archivo de análisis de datos.
Para medir la distribución del tamaño del agregado, comience por trazar un histograma del área de la población de eventos de agregación. Guarde el análisis de datos haciendo clic en el archivo y seleccionando la opción Guardar como plantilla. Después de guardar, abra el siguiente archivo de muestra con la misma plantilla para el archivo de análisis de datos.
Se observaron células individuales, agregados pequeños, agregados grandes y cadenas en LGG y L. paracasei, pero no fue posible distinguir entre cadenas y agregados más grandes. Se observaron variaciones significativas en las características de agregación de diferentes cepas de BAL en respuesta a azúcares fermentables o no fermentables.
