Iniciar el cultivo de cinco veces 10 a la quinta células DF-1 por pocillo en una placa de seis pocillos con DMEM suplementado con 10% de FBS. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, deseche el suero que contiene el medio de cultivo celular. Después de lavar las células tres veces con PBS, agregue dos mililitros de medio de cultivo celular sin suero, seguido de una solución de virus IBDV a cada pocillo.
Después de una hora de absorción del virus, lavar las células con PBS tres veces e incubarlas durante 24 horas con dos mililitros de DMEM suplementado con 2% de FBS. Agregue 500 microlitros de tripsina por pocillo, seguidos de dos mililitros de DMEM con 10% de FBS después de un minuto. Centrifugar las células y retirar el sobrenadante con cuidado.
Después de resuspender el gránulo celular en PBS, vórtice suavemente el tubo durante tres segundos y centrifugue las células como se describió anteriormente. Usando un hemocitómetro bajo un microscopio, cuente las células para resuspenderlas en un volumen apropiado de tampón de tinción de citometría de flujo y vórtice la suspensión. Agregue 100 microlitros de la suspensión de una sola celda en un tubo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros.
Incubar las células infectadas por el IBDV y simular las células de control con un microgramo de anticuerpo apropiado en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Tubo de vórtice suave cada 10 minutos. Lave las células con un mililitro de tampón de tinción de citometría de flujo y centrifugue el tubo.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón de tinción por citometría de flujo. Luego incube las células con 10 microgramos por mililitro de yoduro de propidio durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Y agregue 400 microlitros de tampón de tinción de citometría de flujo para el ensayo de citometría de flujo.
Realice la citometría de flujo con el tubo de control en blanco seguido de los tubos teñidos individuales para ajustar el voltaje y los parámetros de compensación antes de ejecutar todas las muestras. La citometría de flujo indicó que un número considerable de células eran positivas para fragmentos N-terminales de Gasdermin E de pollo después de la infección por IBV, mientras que los fragmentos C-terminales de Gasdermin E de pollo escindido apenas eran detectables por citometría de flujo utilizando tinción de antígeno de superficie de membrana. La población de fragmentos N-terminales de células dobles positivas de Gasdermin E de pollo y yoduro de propidio en células infectadas por IBDV fue significativamente mayor que la de los controles infectados simulados, lo que sugiere que esta parte de las células infectadas por IBDV estaba sufriendo piroptosis.
