Para comenzar, prepare la solución de recubrimiento adecuada en tampón Tyrode modificado y cubra un microportaobjetos de ocho pocillos incubándolo durante dos horas a 37 grados Celsius. A continuación, lave el microportaobjetos recubierto dos veces con el tampón Tyrode modificado. Incubar el microportaobjetos en un tampón Tyrode modificado que contenga cinco miligramos por mililitro de BSA durante al menos 30 minutos para apagar la adhesión inespecífica.
Para preparar las plaquetas lavadas, centrifugar la sangre entera anticoagulada con citrato a 200 G durante 20 minutos para obtener plasma rico en plaquetas. A continuación, añada indometacina y PGE1 al plasma rico en plaquetas y centrifugar a 500 g durante 10 minutos. Vuelva a suspender el gránulo de plaquetas resultante en el tampón HEPES de Tyrode modificado a 37 grados centígrados para lograr una densidad de cuatro veces 10 elevado a la potencia de siete plaquetas por mililitro.
Deje reposar las plaquetas aisladas durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, agregue la solución de DHE a la suspensión de plaquetas para lograr una concentración final de 10 micromolares e incube a 37 grados centígrados durante un minuto. Después de la incubación, retire la solución de bloqueo del microportaobjetos y colóquela en la platina del microscopio para obtener imágenes.
A continuación, dispense suavemente las plaquetas. Utilice una lente de inmersión en aceite 40X en un microscopio confocal invertido para controlar la conversión de DHE en 2-hidroxietidio. Imagen durante 10 minutos, recopilando imágenes cada 10 segundos.
Para monitorear la generación de aniones superóxido en respuesta a un agonista, agregue un agonista soluble 10 minutos después de dispensar las plaquetas y recopile imágenes de fluorescencia durante 10 minutos adicionales. Utilizando este protocolo, se estudió la generación de radicales superóxido durante la adhesión plaquetaria al colágeno o fibrinógeno, y a partir de plaquetas adheridas a PLL estimuladas con trombina.
