Para empezar, obtenga plasma rico en plaquetas centrifugando la sangre total anticoagulada con citrato a 200 g durante 20 minutos. Añadir indometacina y PGE1 al plasma y centrifugar a 500 g durante 10 minutos. Vuelva a suspender el pellet de plaquetas resultante en el tampón HEPES de Tyrode modificado a 37 grados Celsius para obtener una densidad de 2x10^8 plaquetas por mililitro.
Deja reposar las plaquetas durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Añadir DETC a una concentración final de cinco micromolares y deferoxamina a una concentración final de 25 micromolares en la suspensión de plaquetas, seguido de CMH a una concentración final de 200 micromolares. Coloque las muestras en cubetas de agregación equipadas con imanes de agitación recubiertos de teflón y cárguelas en el agregador.
Al cabo de un minuto, añadir estímulos como la trombina o el colágeno, e incubar durante 10 minutos. Después de la incubación, transfiera la suspensión de plaquetas de la cubeta de agregación a un tubo de microcentrífuga y gire rápidamente a 6.000 g durante 10 segundos. Cargue 50 microlitros del sobrenadante en micropipetas capilares y selle con cera de sellado EPR.
Transfiera las muestras al escáner EPR y configure los parámetros en el escáner. Estime la oxidación de CMH a radical CM como el área bajo la curva de los picos EPR registrados. Obtenga una curva de calibración utilizando el radical CM disponible en el mercado.
La intensidad de la señal EPR en las muestras fue proporcional a la intensidad de los picos EPR. La especificidad de la detección se confirmó con eliminadores de ROS e inhibidores selectivos de enzimas generadoras de anión superóxido. Los datos de estimulación plaquetaria con trombina o colágeno en presencia del inhibidor selectivo VAS2870 sugerido que las NADPH oxidasas son la principal fuente de aniones superóxido plaquetario en respuesta a estos dos agonistas.
