Esta investigación contó con el apoyo del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número 1R01HL149404-01A1 (BL), y el Premio Ruth L. Kirschstein del Servicio Nacional de Investigación T32 HL 007936 al Centro de Investigación Cardiovascular (JB) de la Universidad de Wisconsin-Madison. Las figuras fueron creadas o editadas con Biorender.com. El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 10.

Evaluación del desarrollo de aneurisma aórtico en ratones después del tratamiento con elastasa

<ol>
	<li>Kent, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Abdominal+aortic+aneurysms.">Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms.</a> New Engl J Med. 371 (22), 2101-2208 (2014).</li><li>Wanhainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Society+for+Vascular+Surgery+Guidelines+on+the+management+of+aorto-iliac+abdominal+aortic+aneurysms.">European Society for Vascular Surgery Guidelines on the management of aorto-iliac abdominal aortic aneurysms.</a> Eur J Vasc Endocasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).</li><li>Shimizu, K., Mitchell, R. N., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cellular+immune+responses+in+abdominal+aortic+aneurysms.">Inflammation and cellular immune responses in abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 987-994 (2006).</li><li>Shen, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+aneurysms+and+dissections+series.">Aortic aneurysms and dissections series.</a> ArteriosclerThromb Vasc Biol. 40 (3), e37-e46 (2020).</li><li>Stanley, J. C., Veith, F., Wakefield, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Therapy+in+Vascular+and+Endovascular+Surgery+E-Book.">Current Therapy in Vascular and Endovascular Surgery E-Book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2014).</li><li>Morgan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+novel+mechanisms+of+abdominal+aortic+aneurysm+via+unbiased+proteomics+and+systems+biology.">Identifying novel mechanisms of abdominal aortic aneurysm via unbiased proteomics and systems biology.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 889994 (2022).</li><li>Yin, L., Kent, E. W., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+murine+models+of+ruptured+abdominal+aortic+aneurysm.">Progress in murine models of ruptured abdominal aortic aneurysm.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 950018 (2022).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chronic+advanced+stage+abdominal+aortic+aneurysm+murine+model.">A novel chronic advanced stage abdominal aortic aneurysm murine model.</a> J Vasc Surg. 66 (1), 232-242 (2017).</li><li>Berman, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+aortic+aneurysm+severity+and+growth+depend+on+topical+elastase+concentration+and+lysyl+oxidase+inhibition.">Experimental aortic aneurysm severity and growth depend on topical elastase concentration and lysyl oxidase inhibition.</a> Sci Rep. 12 (1), 99 (2022).</li><li>Deaths, percent of total deaths, and death rates for the 15 leading causes of death in 5-year age groups, by race, and sex. Centers for Disease Control and Prevention Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm</a> (2015)</li><li>Dansey, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+endovascular+and+open+repair+for+abdominal+aortic+aneurysms+in+the+United+States+from+2004+to+2015+and+implications+for+screening.">Epidemiology of endovascular and open repair for abdominal aortic aneurysms in the United States from 2004 to 2015 and implications for screening.</a> J Vasc Surg. 74 (2), 414-424 (2021).</li><li>Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysms.">Mouse models of abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).</li><li>Busch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysm+to+the+translational+needs+of+vascular+surgery.">Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery.</a> JVS Vasc Sci. 2, 219-234 (2021).</li><li>Anidjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase-induced+experimental+aneurysms+in+rats.">Elastase-induced experimental aneurysms in rats.</a> Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).</li><li>Bhamidipati, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+murine+model+of+aortic+aneurysms+using+peri-adventitial+elastase.">Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase.</a> Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).</li><li>Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+abdominal+aortic+aneurysm+model+induced+by+perivascular+application+of+elastase.">Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase.</a> J Vis Exp. (180), e63608 (2022).</li></ol>

Los autores de este manuscrito no tienen conflictos de intereses que declarar.

Comprender la compleja fisiopatología del AAA es fundamental para mejorar el tratamiento de la enfermedad por aneurisma aórtico. Si bien se desarrollan activamente nuevas estrategias para mejorar los resultados quirúrgicos, los AAA siguen siendo prevalentes en nuestra sociedad envejecida y la ruptura de un aneurisma sigue siendo una de las principales causas de muerte enlos Estados Unidos. Por lo tanto, las necesidades insatisfechas en las estrategias de detección, prevención y tratamiento de AAA justifican una mayor investigación fundamental sobre el aneurisma11.
Los modelos animales que recapitulan de manera precisa y eficiente las características y comportamientos de los AAA humanos son esenciales para los estudios mecanicistas de la fisiopatología de los aneurismas y la identificación de posibles objetivos terapéuticos. Si bien los modelos animales actuales pueden imitar los aspectos principales de los cambios aneurismales que ocurren en las enfermedades humanas, ningún modelo único representa completamente la verdadera complejidad de los AAA humanos. En la actualidad, los ratones son la especie más ampliamente aceptada para el modelado animal de AAA. Los investigadores deben considerar las diversas fortalezas y debilidades de cada modelo murino para su estudio particular de aneurisma, como los descritos por expertos en las revisiones de Daugherty et al. y Busch et al.12,13.
El uso de elastasa para inducir AAA en roedores fue descrito por primera vez por Anidjar et al. en 1990:14. La perfusión de la aorta con elastasa pancreática porcina mediante una bomba de jeringa crea una dilatación inicial de aproximadamente entre el 50% y el 70%, y los segmentos dilatados muestran favorablemente características patológicas similares a las de los AAA humanos, como la degeneración medial y la inflamación adventicia. Sin embargo, el modelo clásico de perfusión es posiblemente el modelo de aneurisma más desafiante desde el punto de vista técnico, y los aneurismas que generalmente se forman en la segunda semana comienzan a resolverse gradualmente a partir de entonces. Bhamidipati et al. en 2012 demostraron que la aplicación adventicial de elastasa también podría inducir con éxito aneurismas similares que son más reproducibles en tamaño15. Un modelo mucho menos desafiante, el modelo de elastasa tópica se adoptó ampliamente en la investigación de aneurismas. La metodología adicional y las ventajas del modelo de elastasa tópica se discuten en el artículo de métodos de Xue y colegas16.
El modelo elastasa/BAPN del AAA murino fue desarrollado por Lu y sus colegas en 20178. La introducción del agua potable con un 0,2% de BAPN mejoró muchas de las críticas al modelo clásico de elastasa tópica, que ahora produce aneurismas que se expanden continuamente hasta el punto de la ruptura del AAA. En su estudio de 2017, demostraron que los ratones del grupo tratado con elastasa/BAPN tenían tasas de formación de AAA significativamente más altas en comparación con el grupo de elastasa (93% frente a 65%, P < 0,01), que también eran AAA en etapas más avanzadas. Durante un período de estudio de 100 días, los AAA en el grupo de elastasa/BAPN continuaron dilatándose hasta un diámetro basal del >800% y formaron trombo intraluminal (53,8%), y el 46,2% se rompieron espontáneamente antes del final del experimento. Este modelo ha permitido a los investigadores investigar factores que pueden afectar la progresión y la estabilidad del aneurisma a lo largo del tiempo.
Berman et al. exploraron más a fondo el modelo de elastasa/BAPN variando la concentración de elastasa tópica, la duración del estudio, el momento de la administración de BAPN y el impacto del sexo del animal9. El tratamiento con 5 μL de elastasa de mayor concentración (5 mg/mL o 10 mg/mL) produjo aneurismas más grandes que 2,5 mg/mL durante 56 días. La prevalencia de la formación de trombos intraluminales también dependió de la concentración de elastasa, que se produjo en el 28,6% de los ratones tratados con 5 mg/mL y en el 62,5% de los ratones tratados con 10 mg/mL. También demostraron que el modelo de elastasa/BAPN podía inducir aneurismas en ratones hembra. Aunque solo se estudiaron unos pocos ratones hembra (n = 5), encontraron que los aneurismas en las hembras eran más propensos a romperse (2 de 5 ratones) y eran significativamente más grandes que los AAA masculinos a los 56 días.
En este artículo, nuestro objetivo es proporcionar un método para abordar una de las mayores limitaciones del modelado quirúrgico, que es la variación en el procedimiento quirúrgico. Sin un consenso claro sobre el grado de disección y el área de la aorta tratada con elastasa, los resultados de este modelo podrían variar drásticamente entre animales, investigadores e instituciones. Hemos observado numerosas variaciones anatómicas entre ratones, incluyendo el número y tamaño de las arterias y venas lumbares, y la localización del IMA, el despegue de la vena gonadal izquierda, entre otras, que pueden ser limitantes cuando se intenta tratar solo una porción o segmento específico de la aorta infrarrenal. Aquí, demostramos que la disección circunferencial de toda la longitud de la aorta infrarrenal desde la arteria renal izquierda proximalmente a la bifurcación aórtica distalmente ayuda a proporcionar grados reproducibles de exposición aórtica a pesar de las diferencias anatómicas, al tiempo que aumenta el éxito de la inducción del aneurisma y proporciona límites claros para el operador. Además, el tamaño y la posición más anterior de la VCI tienden a cubrir la mayor parte de la aorta, lo que puede afectar la cantidad de aorta tratada si no se aísla de la VCI. Si bien es necesario extirpar la fascia retroperitoneal para exponer la aorta, es importante no diseccionar completamente el tejido conectivo de la adventicia de la aorta y exponer ninguna de las capas medias, ya que esto generalmente resulta en una ruptura durante el período de incubación de elastasa de 5 minutos. Esto podría servir como un control interno adicional al grado de disección con este modelo, pero puede ser una curva de aprendizaje frustrante al adoptar este modelo. Además, los operadores aprenderán las áreas de mayor riesgo (Figura 4) que pueden lesionarse fácilmente durante la cirugía y provocar una hemorragia incontrolable.
Si bien es importante que los pasos del procedimiento de este modelo sean coherentes, la duración del estudio y el momento de la ecografía de intervalo pueden variar según el objetivo de la investigación. La dilatación aórtica comienza inmediatamente con la aplicación de elastasa, sin embargo, los estudios que utilizan este modelo suelen seguir a los ratones durante 28 días después de la cirugía7, como en este experimento de ejemplo. Se debe considerar la extensión de la duración del estudio cuando se estudian AAA avanzados, crecimiento a largo plazo, formación de trombos intraluminales o ruptura.
Las medidas perioperatorias adicionales, como mantener la temperatura corporal y el estado de hidratación de los animales, pueden ayudar a mejorar la supervivencia de los animales a este procedimiento invasivo. El uso de una almohadilla térmica durante la cirugía y la colocación en una jaula de recuperación tibia pueden ayudar a evitar la hipotermia. La solución salina debe calentarse antes de usarla para irrigar la cavidad abdominal. Un bolo de líquido subcutáneo inmediatamente después de la cirugía puede explicar pérdidas insensibles de líquido durante la operación y ayudar al animal a mantener una hidratación adecuada durante la fase de recuperación inmediata. Con un manejo cuidadoso de los tejidos y un enfoque metódico consistente, el modelo de elastasa/BAPN puede ser realizado por un operador experimentado entre 30 min y 45 min por ratón y producir de manera confiable AAA con complicaciones perioperatorias muy bajas.
Nuestros resultados demuestran que la combinación de BAPN además de la disección circunferencial de la aorta infrarrenal antes de la aplicación de elastasa produce AAAs grandes y en continua expansión, con diámetros mayores e incidencia de ruptura en períodos más cortos. En este experimento, los AAA se indujeron con éxito en todos los ratones machos (6 de 6) y hembras (6 de 6) tratados con elastasa activa. La exposición a la elastasa durante 5 minutos resultó en un aumento inmediato del diámetro aórtico en aproximadamente un 30-40%, lo que es útil para confirmar la aplicación exitosa y consistente de elastasa entre los grupos de tratamiento. Al igual que Berman et al., hemos demostrado que este modelo puede inducir AAAs en ratones hembra, que también tienen una mayor respuesta a la ruptura que los machos. La mitad de los ratones hembra (3 de 6) se rompieron dentro de los 28 días, en comparación con 0 de 6 de los machos, sin embargo, los ratones hembra pesan menos que los machos. Los ratones machos demostraron un aumento en el diámetro de AAA en un 257% en comparación con el -4% de los controles masculinos, mientras que las hembras sobrevivientes mostraron un aumento del diámetro del 417%, en comparación con el -16% de las hembras de control. Los diámetros aórticos no fueron significativamente diferentes entre los ratones macho y hembra tratados a los 28 días debido al mayor número de rupturas en el grupo de hembras. Especulamos que los ratones simulados exhiben diámetros aórticos más pequeños al final del estudio, ya que la aorta tiende a dilatarse ligeramente durante la disección inicial y luego forma tejido cicatricial a los 28 días.
El modelo elastasa/BAPN posee ciertas limitaciones. La disección circunferencial de la aorta requiere habilidades quirúrgicas finas, pero ayuda a mejorar la replicabilidad y el grado de inducción del aneurisma. Al igual que el modelo de elastasa tópica, también hay un efecto de lote en la actividad de la enzima elastasa, que, como se mencionó anteriormente, es importante utilizar la misma botella de elastasa para todos los animales en un experimento determinado. Si bien la incidencia de trombo y ruptura intraluminal del AAA aumenta con el tiempo y la gravedad del aneurisma, estos no están garantizados ni son totalmente predecibles en este modelo.
En resumen, el modelo de elastasa/BAPN produce AAAs infrarrenales grandes y verdaderos en ratones machos y hembras, que se expanden progresivamente con el tiempo, forman trombos intraluminales y son capaces de romperse. Estas fortalezas de este modelo murino ayudan a recapitular mejor algunos de los comportamientos y características de los aneurismas en humanos. Aunque técnicamente difícil, la disección cuidadosa y completa de la aorta puede aumentar la respuesta aneurismática. En la actualidad, el método elastasa/BAPN es un modelo avanzado para el estudio de los aneurismas de aorta abdominal infrarrenal.

Un aneurisma se define como una dilatación patológica de un vaso sanguíneo mayor del 50% del diámetro del vaso sano1. A pesar de que los aneurismas de aorta abdominal (AAA) son una afección común en la población envejecida, con una incidencia de aproximadamente el >5% de los hombres > 65 años de edad, no existen estrategias terapéuticas dirigidas para tratar el AAA1. El tratamiento actual del AAA se limita a la reducción de los factores de riesgo y a la reparación quirúrgica con cirugía abierta o endovascular basada en el diámetro aórtico o la tasa de crecimiento2. El mayor peligro del AAA es la rotura del aneurisma, que es mortal si no se trata, y la reparación en este entorno emergente puede conllevar riesgos de mortalidad de hasta el 90%1.
La fisiopatología del AAA es complicada, multifactorial y no se comprende completamente3. Las características del AAA humano incluyen una verdadera dilatación aneurismática de la pared aórtica con infiltración de células inflamatorias, la presencia de trombo intraluminal y una dilatación progresiva que conduce a una eventual ruptura 3,4. Además, los AAA se asocian con la edad avanzada, tienen un predominio sexual masculino:femenino de 9:1 y ocurren con mayor frecuencia en la aorta infrarrenal5. Modelar todas las características y comportamientos de los AAA humanos en animales sigue siendo un desafío continuo6.
El modelo actual de AAA se lleva a cabo principalmente en ratones, y los aneurismas se inducen comúnmente utilizando uno de tres métodos: por infusión de angiotensina II (AngII) a través de una bomba osmótica implantada subcutáneamente, y por aplicación directa de cloruro de calcio (CaCl2) o elastasa a la aorta7. En este último método, la elastasa pancreática porcina (EPP) se aplica a un segmento de la aorta infrarrenal y provoca la degradación enzimática de las fibras de elastina dentro de la lámina elástica de la túnica media. Este daño estructural resulta en el debilitamiento de la pared aórtica y la dilatación externa del aneurisma. Sin embargo, el uso de elastasa tópica sola produce aneurismas infrarrenales relativamente pequeños, que no se agrandan ni se rompen progresivamente con el tiempo. Más recientemente, Lu et al. mejoraron este modelo mediante la administración adicional de β-aminopropionitrilo (BAPN), un inhibidor irreversible de la lisil oxidasa, a sus ratones tratados con elastasa. Al evitar la reticulación de las fibras de elastina y colágeno, la suplementación con BAPN hace que las aortas dañadas por la elastasa se dilaten progresivamente hasta el punto de ruptura. Además, el modelo de elastasa/BAPN tiene una mayor tasa de incidencia de AAA que el modelo de elastasa tópica, y los aneurismas producidos también son más grandes y contienen trombo intraluminal8.
En el modelo de elastasa/BAPN, el grado de disección quirúrgica y la exposición de la aorta a la elastasa pueden afectar el éxito y la replicabilidad de este modelo. En este manuscrito, describimos que la co-administración de agua potable de BAPN y la aplicación tópica de elastasa a la aorta después del aislamiento circunferencial de todo el segmento aórtico infrarrenal mejora la replicabilidad, explica las diferencias anatómicas entre animales y da como resultado una mayor tasa de inducción de AAA, tamaños de aneurismas e incidencia de rupturas. En este artículo, describiremos un enfoque estandarizado para inducir de manera confiable aneurismas de aorta abdominal avanzados en ratones utilizando una combinación de elastasa tópica y agua suplementada con BAPN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 L induction chamber</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0530XXS</td>
			<td>anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodicum chloride injection, USP, 20 mL</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-03</td>
			<td>normal saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe Luer-Lok Tip with BD PrecisionGlide Needle 22 G x 3/4</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309569</td>
			<td>syringe, 22 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>A0796</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3134-25G</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avant Delux gauze sponges, 2&#34; x 2&#34; 4-Ply</td>
			<td>Medline</td>
			<td>NON26224</td>
			<td>gauze sponges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balding clipper</td>
			<td>Whal Clipper Corporation</td>
			<td>8110</td>
			<td>hair clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)</td>
			<td>Avrio</td>
			<td>NCD 67618-154-16</td>
			<td>betadine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5130</td>
			<td>blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine ER-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>BERLAB0.5</td>
			<td>buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-131-11</td>
			<td>carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO 5.75&#34; straight with lock</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>Castroviejo needle driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton tipped wood applicators, 6&#34;</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>No. 4302</td>
			<td>cotton tipped wood applicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESMARRES 5.5&#39; rectractor&#160;</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6672</td>
			<td>skin rectractor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital caliper, 0-150 mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td>digital caliper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase from porcine pancrease Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1250-10MG</td>
			<td>elastase &#62;4.0 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td>ethanol diluted to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye lube</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td>14716</td>
			<td>eye lube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 dry sterilizer</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>dry bead sterilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy mat</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>V016</td>
			<td>heat therapy mat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy pump</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>HTP-1500</td>
			<td>heat therapy pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>NCD 59399-106-01</td>
			<td>isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-10 pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>LTS 0.5-10 uL</td>
			<td>pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile anesthesia mask, small</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0801</td>
			<td>anesthesia nose cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro dissector scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5619</td>
			<td>micro dissector scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nii-LED high intensity LED illuminatorLED exertnal light</td>
			<td>Nikon Instruments, Inc</td>
			<td>83359 NII-LED</td>
			<td>external dissection light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon 5-0 monofilament, black non-absorbable suture</td>
			<td>Oasis</td>
			<td>MV-661-V</td>
			<td>5-0 nylon suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyisoprene surgical gloves, GAMMEX Non-Latex PI Micro, size 7.5</td>
			<td>Ansell</td>
			<td>20685975</td>
			<td>non-latex surgical gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 mm stainless steel wound clips</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>203-1000</td>
			<td>wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>Compass CR2200</td>
			<td>scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnofFlo Accessory Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>10-8000-71</td>
			<td>tubing for electronic vaporizer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoFlo electronic vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SF2992</td>
			<td>low-flow electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoPath Flow Diverter</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SP1016</td>
			<td>flow diverter for electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS/45 sharp forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-4941</td>
			<td>sharp forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6010SC</td>
			<td>surgical scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vessel forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>VES 0.35</td>
			<td>vessel forceps</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced abdominal aortic aneurysm modeling in mice by combination of topical elastase and oral &#223;-aminopropionitrile

El modelo murino de elastasa tópica de aneurisma de aorta abdominal (AAA) mejora cuando se combina con agua potable suplementada con ß-aminopropionitrilo (BAPN) para producir de manera confiable verdaderos aneurismas infrarrenales con comportamientos que imitan los AAA humanos. La aplicación tópica de elastasa a la adventicia de la aorta infrarrenal provoca daño estructural en las capas elásticas de la pared aórtica e inicia la dilatación del aneurisma. La coadministración de BAPN, un inhibidor de la lisil oxidasa, promueve la degeneración sostenida de la pared al reducir la reticulación de colágeno y elastina. Esta combinación da lugar a grandes AAA que se expanden progresivamente, forman trombos intraluminales y son capaces de romperse. El perfeccionamiento de las técnicas quirúrgicas, como el aislamiento circunferencial de todo el segmento aórtico infrarrenal, puede ayudar a estandarizar el procedimiento para una aplicación consistente y completa de la elastasa pancreática porcina a pesar de los diferentes operadores y las variaciones anatómicas entre ratones. Por lo tanto, el modelo de elastasa/BAPN es un enfoque refinado para la inducción quirúrgica de AAA en ratones, que puede recapitular mejor los aneurismas humanos y proporcionar oportunidades adicionales para estudiar el crecimiento de los aneurismas y el riesgo de ruptura.

En este estudio se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6J de 22 a 24 semanas de edad. Las aortas infrarrenales se trataron con 5 μL de enzima elastasa (6,9 mg de proteína/mL, 6 unidades/mg de proteína) o elastasa desnaturalizada durante 5 min. Los ratones machos tratados con elastaso mostraron un aumento del 43,4% en el diámetro aórtico después de 5 minutos de exposición a la elastasa en comparación con los diámetros aórticos basales no tratados, mientras que las aortas femeninas tratadas aumentaron un 33,6% (P = 0,0342). Los diámetros aórticos de las mascarillas no mostraron cambios durante 5 minutos de exposición a la elastasa desnaturalizada (hombres 0,5%; mujeres -2,8%). No hubo muertes relacionadas con la cirugía entre los 12 ratones tratados y los 6 ratones simulados. Los datos del estudio de 28 días se muestran en la Tabla 1. De los ratones hembra tratados, 3 de 6 murieron por rotura de AAA; uno el día 20 del postoperatorio y dos el día 25 (Figura 6). No hubo rupturas de AAA entre los hombres tratados. Los AAA (definidos como un aumento >50% del diámetro basal de la aorta o la muerte por ruptura de AAA) se indujeron con éxito en todos los ratones tratados (12 de 12). A los 28 días, el diámetro promedio de AAA de los machos tratados fue de 2,86 ± 0,31 mm, con un cambio porcentual promedio de 257 ± 54%, mientras que los diámetros de AAA de los ratones hembra tratados sobrevivientes fueron de 3,60 ± 1,87 mm, con un cambio porcentual promedio de 417 ± 286% (Figura 7). Los ratones simulados no mostraron relativamente ningún cambio en los diámetros aórticos.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig06.jpg"> Figura 6: Supervivencia de ratones B6 machos y hembras durante un modelo de elastasa/BAPN de AAA de 28 días. (A) La ruptura de AAA ocurrió en 3 de los 6 ratones hembra tratados (un ratón a los 20 días, luego dos ratones a los 25 días), mientras que no hubo rupturas entre los 6 ratones machos tratados a los 28 días. (B) Imágenes representativas en la necropsia de un ratón hembra que murió por rotura de AAA. La rotura del AAA se manifiesta por un gran hematoma retroperitoneal (izquierda) y la presencia de un AAA infrarrenal con un defecto de la pared (derecha). Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrilo; AAA = aneurisma de aorta abdominal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig07.jpg"> Figura 7: Diámetros aórticos máximos de elastasa/BAPN y ratones B6 machos y hembras simulados a los 28 días. (A) Los ratones tratados exhiben diámetros infrarrenales significativamente mayores a los 28 días en comparación con los simulados. (B) La combinación de elastasa y BAPN produce con éxito grandes AAA infrarrenales en ratones B6 machos y hembras. Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrilo; AAA = aneurisma de aorta abdominal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"></td>
			<td>86 hombres Sham</td>
			<td>86 Mujer Sham</td>
			<td>86 elastaso macho/8APN</td>
			<td>86 elastaso hembra/8APN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Número de ratones</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Edad (semanas)</td>
			<td>22,3 ± 0,0</td>
			<td>22,7 ± 0,7</td>
			<td>23,1 ± 0,2</td>
			<td>23,2 ± 0,2</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Peso (g; en el momento de la cirugía)</td>
			<td>36,3 ± 2,5</td>
			<td>23,7 ± 1,2</td>
			<td>32,8 ± 1,7*</td>
			<td>23,7 ± 0,8</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diámetro aórtico previo al tratamiento (mm)</td>
			<td>0,89 ± 0,02</td>
			<td>0,75 ± 0,04</td>
			<td>0,81 ± 0,07</td>
			<td>0,73 ± 0,09</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diámetro aórtico post-tratamiento (mm)</td>
			<td>0,90 ± 0,03</td>
			<td>0,73 ± 0,01</td>
			<td>1,15 ± 0,03**</td>
			<td>0,98 ± 0,12**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Cambio porcentual después de 5 min de tratamiento (%)</td>
			<td>0,5 ± 4,4</td>
			<td>-2,8 ± 5,3</td>
			<td>43,4 ± 10,2***</td>
			<td>33,6 ± 4,5***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incidencia de AAA (%)</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>6 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">El AAA se rompe a los 28 días</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Supervivencia hasta 28 días</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diámetro aórtico máximo a los 28 días (mm)</td>
			<td>0,85 ± 0,01</td>
			<td>0,64 ± 0,01</td>
			<td>2,86 ± 0,31*</td>
			<td>3,60 ± 1,87**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Cambio porcentual del diámetro aórtico a los 28 días (%)</td>
			<td>-4 ± 2</td>
			<td>-16 ± 2</td>
			<td>257 ± 54*</td>
			<td>417 ± 286**</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Resultados de un modelo de 28 días del modelo murino de elastasa/BAPN de AAA. Los datos se ± media de DE. *P<0.05, **P<0.005, ***P<0.0001 en comparación con simulacros del mismo sexo a través de la prueba de Fischer ANOVA de un factor. Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrilo; AAA = aneurisma de aorta abdominal.

Autor destacado: Modelo AAA murino mejorado que utiliza elastasa para imitar aneurismas humanos

Este protocolo describe un enfoque quirúrgico metódico para modelar aneurismas de aorta abdominal avanzados en ratones mediante una combinación de aplicación directa de elastasa a la aorta infrarrenal y administración de ß-aminopropionitrilo a través del agua potable.

Modelado avanzado de aneurisma de aorta abdominal en ratones mediante combinación de elastasa tópica y ß-aminopropionitrilo oral

The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking ...

advanced-abdominal-aortic-aneurysm-modeling-mice-combination-topical

Research

JoVE Journal

Biology

Advanced Abdominal Aortic Aneurysm Modeling in Mice by Combination of Topical Elastase and Oral &#223;-aminopropionitrile

1.1K vistas.  University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health. Nuestra investigación tiene como objetivo comprender la fisiopatología del aneurisma de aorta abdominal. En particular, nos gusta saber en el término molecular cómo se rompe el aneurisma. Creemos que el modelado de aneurisma aórtico en ratones, machos y hembras, nos ayudará a desarrollar un nuevo tratamiento para esta enfermedad altamente letal que necesita tratamiento farmacológico urgente.La fisiopatología del aneurisma de aorta abdominal es ...

Video: Autor destacado: Modelo AAA murino mejorado que utiliza elastasa para imitar aneurismas humanos

Creation of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysms with Elastase 

Transient intraluminal infusion of porcine pancreatic elastase into the infrarenal segment of the abdominal aorta is the most widely used animal model of abdominal aortic aneurysm (AAA) ever since it was first described in rats by Anidjar and colleagues.1 The rationale for its development was based on the disrupted nature of elastin observed in AAAs. This rat model has been modified to produce AAAs in the infrarenal aortic region of mice.2 The model has the ability to add broad insight into the pathobiology of AAA due to the emergence of numerous transgenic and gene knockout mice. Moreover, it is a viable platform to test potential therapeutic agents for AAA. In this video, we demonstrate the elastase infusion AAA procedure used in our laboratory. 
Mice are anesthetized using 2.5% isoflurane, and a laparotomy is performed under sterile conditions. The abdominal aortais isolated with the assistance of an operating stereomicroscope (Leica). After placing temporary ligatures around the proximal and distal aorta, an aortotomy is created at the bifurcation with the tip of a 30-gauge needle. A heat-tapered segment of PE-10 polyethylene tubing is introduced through the aortotomy and secured. The aortic lumen is subsequently perfused for 5-15 minutes at 100 mm Hg with saline containing type I porcine pancreatic elastase (4.5 U/mL; Sigma Chemical Co.). After removing the perfusion catheter, the aortotomy is repaired without constriction of the lumen.

Creation of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysms with Elastase

This video shows how to induce abdominal aortic aneurysms (AAA) in mice via transient intraluminal infusion of porcine pancreatic elastase into the infrarenal segment of the abdominal aorta. The model has the ability to add broad insight into the pathobiology of AAA due to the emergence of numerous transgenic and gene knockout mice.

Creación de murino Experimental aneurismas de aorta abdominal con elastasa

Transient intraluminal infusion of porcine pancreatic elastase into the infrarenal segment of the abdominal aorta is the most widely used animal model of ...

Investigación

Biología

Transverse Aortic Constriction in Mice

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart failure.1 TAC initially leads to compensated hypertrophy of the heart, which often is associated with a temporary enhancement of cardiac contractility. Over time, however, the response to the chronic hemodynamic overload becomes maladaptive, resulting in cardiac dilatation and heart failure.2 The murine TAC model was first validated by Rockman et al.1, and has since been extensively used as a valuable tool to mimic human cardiovascular diseases and elucidate fundamental signaling processes involved in the cardiac hypertrophic response and heart failure development. When compared to other experimental models of heart failure, such as complete occlusion of the left anterior descending (LAD) coronary artery, TAC provides a more reproducible model of cardiac hypertrophy and a more gradual time course in the development of heart failure. Here, we describe a step-by-step procedure to perform surgical TAC in mice. To determine the level of pressure overload produced by the aortic ligation, a high frequency Doppler probe is used to measure the ratio between blood flow velocities in the right and left carotid arteries.3, 4 With surgical survival rates of 80-90%, transverse aortic banding is an effective technique of inducing left ventricular hypertrophy and heart failure in mice.

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model to study mechanisms underlying cardiac hypertrophy and heart failure development. Here, we describe procedures to constrict the aorta to create a reproducible degree of cardiac hypertrophy in mice.

Constricción de la aorta transversa en ratones

Transverse aortic constriction (TAC) in the mouse is a commonly used experimental model for pressure overload-induced cardiac hypertrophy and heart ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Análisis de la autofagia en<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por la inanición Pads en combinación con microscopía de fluorescencia

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos orales primarios del paladar del ratón adulto

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Mouse Abdominal Aortic Aneurysm Model Induced by Perivascular Application of Elastase

Abdominal aortic aneurysm (AAA), although primarily asymptomatic, is potentially life-threatening as the rupture of AAA usually has a devastating outcome. Currently, there are several distinct experimental models of AAA, each emphasizing a different aspect in the pathogenesis of AAA. The elastase-induced AAA model is the second most used rodent AAA model. This model involves direct infusion or application of porcine pancreatic elastase (PPE) to the infrarenal segment of the aorta. Due to technical challenges, most elastase-induced AAA model nowadays is performed with the external application rather than an intraluminal infusion of PPE. The infiltration of elastase will cause degradation of elastic lamellae in the medial layers, resulting in the loss of aortic wall integrity and subsequent dilation of the abdominal aorta. However, one disadvantage of the elastase-induced AAA model is the inevitable variation of how the surgery is performed. Specifically, the surgical technique of isolating the infrarenal segment of the aorta, the material used for aorta wrapping and PPE incubation, the enzymatic activity of PPE, and the time duration of PPE application can all be important determinants that affect the eventual AAA formation rate and aneurysm diameter. Notably, the difference in these factors from different studies on AAA can lead to reproducibility issues. This article describes a detailed surgical process of the elastase-induced AAA model through direct application of PPE to the adventitia of the infrarenal abdominal aorta in the mouse. Following this procedure, a stable AAA formation rate of around 80% in male and female mice is achievable. The consistency and reproducibility of AAA studies using an elastase-induced AAA model can be significantly enhanced by establishing a standard surgical procedure.

The present protocol describes a standardized surgical method for the elastase-induced AAA model through the direct application of elastase to the adventitia of infrarenal abdominal aorta in mice.

Modelo de aneurisma aórtico abdominal de ratón inducido por la aplicación perivascular de elastasa

Abdominal aortic aneurysm (AAA), although primarily asymptomatic, is potentially life-threatening as the rupture of AAA usually has a devastating outcome. ...

A Modified Technique for Transverse Aortic Constriction in Mice

Transverse aortic constriction (TAC) is a frequently used surgery in research regarding heart failure and cardiac hypertrophy based on the formation of pressure overload in mouse models. The main challenge of this procedure is to clearly visualize the transverse aortic arch and precisely band the target vessel. Classical approaches perform a partial thoracotomy to expose the transverse aortic arch. However, it is an open-chest model that causes a rather large surgical trauma and requires a ventilator during the surgery. To prevent unnecessary trauma and simplify the operating procedure, the aortic arch is approached via the proximal proportion of the sternum, reaching and binding the target vessel using a small self-made retractor that contains a snare. This procedure can be conducted without entering the pleura cavity and does not need a ventilator or microsurgical operation, which leaves the mice with physiological breathing patterns, simplifies the procedure, and significantly reduces operation time. Due to the less invasive approach and less operation time, mice can undergo fewer stress reactions and recover rapidly.

The present protocol describes a modified and simplified technique with a minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) procedure using a self-made retractor. This procedure can be conducted without a ventilator or microscope and introduces pressure overload, eventually leading to cardiac hypertrophy or heart failure.

Una técnica modificada para la constricción aórtica transversa en ratones

Transverse aortic constriction (TAC) is a frequently used surgery in research regarding heart failure and cardiac hypertrophy based on the formation of ...

A Calcium Phosphate-Induced Mouse Abdominal Aortic Aneurysm Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening cardiovascular disease that occurs worldwide and is characterized by irreversible dilation of the abdominal aorta. Currently, several chemically induced murine AAA models are used, each simulating a different aspect of the pathogenesis of AAA. The calcium phosphate-induced AAA model is a rapid and cost-effective model compared to the angiotensin II- and elastase-induced AAA models. The application of CaPO4 crystals to the mouse aorta results in elastic fiber degradation, loss of smooth muscle cells, inflammation, and calcium deposition associated with aortic dilation. This article introduces a standard protocol for the CaPO4-induced AAA model. The protocol includes material preparation, the surgical application of the CaPO4&#160;to the adventitia of the infrarenal abdominal aorta, the harvesting of aortas to visualize aortic aneurysms, and histological analyses in mice.

This protocol describes a calcium phosphate-induced abdominal aortic aneurysm (AAA) mouse model to study the pathological features and molecular mechanisms of AAAs.

Un modelo de aneurisma aórtico abdominal de ratón inducido por fosfato de calcio

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening cardiovascular disease that occurs worldwide and is characterized by irreversible dilation of the ...