Carga de células T CD4⁺ primarias de ratón y recubrimiento de perlas magnéticas de proteína G con anticuerpos para la obtención de imágenes locales de Ca²⁺

Para comenzar, tome células T CD4 positivas aisladas de los ganglios linfáticos y el bazo de ratón. Centrifugar de dos a cinco millones de células durante cinco minutos a 300 g. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 480 microlitros de medio de células T que contengan 10 micromolares Fluo-4 AM y 20 micromolares Fura Red AM. Cubra el tubo Falcon con papel de aluminio e incube las células durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Luego agregue dos mililitros de medio de células T a las células y continúe incubando durante 30 minutos adicionales. Mezcle suavemente la suspensión magnética de perlas de proteína G y transfiera 12,5 microlitros a un tubo nuevo. Coloque el tubo en un soporte magnético para permitir que las cuentas migren al imán.

Pipetea suavemente el tampón de almacenamiento desde el lado opuesto del imán para extraerlo. Para eliminar cualquier búfer de almacenamiento restante, agregue 500 microlitros de PBST y vórtice durante 10 segundos. Vuelva a colocar el tubo en el soporte magnético y retire el tampón.

Para recubrir las perlas con anticuerpos, vuelva a suspenderlas en 7,5 microlitros de PBST y agregue cinco microlitros de anti-CD3 y cinco microlitros de anti-CD28. Incubar durante 30 a 60 minutos mientras se mezcla continuamente a temperatura ambiente. Lave las perlas recubiertas tres veces con 500 microlitros de PBST, seguido de un lavado con 500 microlitros de tampón de calcio utilizando el soporte magnético, luego vuelva a suspender las perlas en 200 a 400 microlitros de tampón de calcio.