El propósito del método es generar una sinapsis inmunológica que es un ejemplo de conjugación de célula a célula formada por una célula que presenta antígeno y un linfocito de T-helper. Nuestro objetivo es registrar las primeras etapas de la formación de la sinapsis inmune y registrar los eventos de tráfico que ocurren en el linfocito T-helper. Estos eventualmente conducirán a la secreción polarizada en la sinapsis inmune.
El enfoque presentado aquí implica conjugación de célula a célula, adquisición de lapso de tiempo, microscopía de fluorescencia de campo amplio y procesamiento de imágenes posterior. Esto mejora la relación señal-ruido de las imágenes, mejora la resolución temporal y permite la adquisición simultánea de varios fluorocromos en conjugados sinápticos emergentes y disminuye el blanqueo por fluorescencia. Además, el protocolo es compatible con protocolos de fijación de células de punto final que permitirán la tinción y análisis de inmunofluorescencia.
Este protocolo también es compatible con la microscopía fluorescente de escaneo láser y otras técnicas de microscopía de última generación. Demostrando el procedimiento estarán Ana Bello, una estudiante de posgrado, Alejandro Garrido, técnico, y Solange Moreno, estudiante de posgrado. Para comenzar este procedimiento, agregue 150 microlitros de fibronectina a cada pozo de un tobogán de cámara de ocho micropocillos e incubarlo a 37 grados centígrados durante 30 minutos a una hora.
Después del período de incubación, aspirar la fibronectina y lavar cada pocótemo con 200 microlitros de PVS durante dos minutos con un suave temblor. Repita este lavado una vez más y deje el segundo lavado en el pozo. Transfiera 10 mililitros de una precultura confluente de las células Raji a un tubo inferior V de 15 mililitros.
Centrifugar a 300 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspendir suavemente el pellet celular en medio caliente y completo a una concentración de 1 millón de células por mililitro. Para etiquetar las células Raji, transfiera el número requerido de células en el medio de cultivo a un tubo de dos mililitros.
Para el portaobjetos de ocho micropocillos, se necesita un total de 1,6 mililitros de suspensión celular. Añadir el azul rastreador celular a una concentración final de 10 micromolares. Resuspender las células manchadas en azul del rastreador celular y transferir 200 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de los portaobjetos de cámara recubiertos con fibronectina preparados.
Incubar el tobogán de la cámara a 37 grados centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono durante 30 minutos a una hora. Después de esto, agitar suavemente las diapositivas de la cámara en el microscopio para asegurarse de que las células Raji se adhieren. Lave cada pozo cuidadosamente con un medio de cultivo celular cálido y completo para eliminar el exceso de azul del rastreador celular.
Asegúrese de que las células Raji se adhieren a la parte inferior de las placas, y muestran huecos entre sí y no son confluentes. 50-60% de la confluencia celular es apropiada. Primero, añadir Enterotoxina Staphylococcal E a una concentración de un microgramo por mililitro a cada pozo.
Asegúrese de que las células Raji son pulsadas con superantigen de lo contrario el receptor de células T de las células Jurkat no reconocerá el SCE y la sinapsis no se formará. Incubar el tobogán de la cámara a 37 grados centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono durante al menos 30 minutos. A continuación, obtener un cultivo previamente creciente de células de Jurkat a una concentración entre 1 y 2 millones de células por milímetro.
Observe las células bajo un microscopio de contraste de fase y luego transfiera las células a un tubo inferior en V de 15 mililitros. Centrifugar a 300 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender suavemente las células en un medio de cultivo cálido y completo a una concentración de 1 millón de células por mililitro.
Luego mantenga las células de Jurkat en cultivo a 37 grados Celsius con cinco por ciento de dióxido de carbono hasta que estén listas para usar. Recupere las diapositivas de la cámara que contienen las células Raji de la incubadora con la etiqueta azul Staphylococcus Enterotoxin E pulsadas Staphylococcus Enterotoxin E. Aspirar cuidadosamente el medio de cultivo de cada pozo uno por uno con una pipeta colocada en una esquina del pozo.
Sustituya inmediatamente el medio con 200 microlitros de las células de Jurkat resuspendidas en el medio de cultivo celular. Si se realiza un lapso de tiempo, proceda rápidamente al microscopio. Localice la diapositiva con cámara en el selector de puesta en escena del microscopio y seleccione algunos campos apropiados.
Prepare el microscopio y la cámara de incubación antes de la toma de imágenes. Después de que las células de Jurkat se hayan añadido a cada pozo que contiene las células Raji, localice rápidamente el deslizamiento de la cámara micropolín en la incubadora escenificada del microscopio precalentado y seleccione algunas posiciones XY. Si sólo se planifica un experimento de punto final, incubar el tobogán de la cámara a 37 grados celsius con un cinco por ciento de dióxido de carbono durante una a dos horas.
Después del período de cultivo, compruebe la formación conjugada y, posteriormente, fije los conjugados como se describe en el protocolo de texto. Para fijar las células, agregue RPMI caliente sin FCS y agite suavemente. Aspirar el RMPI y añadir 200 microlitros de PFA o acetona prechilled a cada pozo.
Incubar el tobogán de la cámara a temperatura ambiente o sobre hielo durante 20 minutos. A continuación, lave cada pozo dos veces con PVS y agregue 200 microlitros de solución de enfriamiento. En este estudio, se generan conjugados de sinapsis inmune Jurkat-Raji y se visualizan correctamente las primeras etapas de la formación de la sinapsis inmunológica.
Esta estrategia induce la formación de sinapsis inmunológica al mismo tiempo que realiza la imagen de lapso de tiempo. Aquí se muestran los conjugados sinápticos representativos Jurkat-Raji obtenidos a partir de esta técnica, incluyendo una imagen del canal de transmitancia, el canal azul del rastreador de celdas y ambos canales fusionados. Algunos conjugados sinápticos se pueden ver, incluyendo aquellos formados por una sola célula de Jurkat y varias células Raji, que son conjugados complejos.
La disminución de las concentraciones celulares evitará la formación de conjugados celulares complejos, pero puede no proporcionar suficientes conjugados celulares para el posterior análisis del tráfico polarizado, lo que a su vez disminuirá las posibilidades de encontrar e imaginar conjugados sinápticos emergentes. Una desconvolución de las imágenes del canal de fluorescencia GFP-CD63 se realiza con un software de desconvolución adecuado utilizando la opción óptica de campo ancho y los parámetros ópticos adecuados. Este canal desenrevesado se fusionó posteriormente con el rastreador de celdas de amplio canal.
Hay una mejora tanto de la relación señal-ruido como de la nitidez. Aquí se muestra una pila Z representativa de un conjugado de sinapsis inmunológica fija. La inmunofluorescencia se realiza utilizando faloideina para visualizar la F-actina, anti-CD63 para visualizar el MVB y la subulina anti gamma para visualizar el MTOC mientras que el rastreador de células de color azul calculó las células Raji.
La transfiguración opcional de las células de Jurkat permitirá la visualización del tráfico de los gránulos secretores en las células vivas. Por ejemplo, cuando se expresa GFP-CD63, se puede grabar el movimiento de las vesículas decoradas por GFP-CD63. El protocolo es compatible con protocolos de fijación de punto final que permitirán más protocolos y análisis de tinción de inmunofluorescencia.
Existen modelos experimentales de productividad que pueden simplificar las imágenes en la sinapsis inmune, pero estos modelos no emulan la superficie compleja e irregular en las células del antígeno-presentador que pueden producir interacciones no fisiológicas en la sinapsis inmune. El enfoque descrito aquí es adecuado para reproducir y confirmar algunas complejidades biológicas que ocurren en la sinapsis inmune. Superantigen es una toxina peligrosa, así que asegúrese de usar guantes y deje caer la punta usada en la caja peligrosa.
