El protocolo permite a los investigadores medir simultáneamente la respuesta al calcio en las células T primarias junto con la evaluación de su subconjunto y fenotipo de superficie. La principal ventaja de esta técnica es que evita la necesidad de aislar subconjuntos específicos de células antes de examinar sus respuestas al calcio. Para comenzar, prepare una solución madre de un microgramo por microlitro de Indo-1 AM agregando 50 microlitros de DMSO en un vial que contenga 50 microgramos de Indo-1 AM. Diluir la solución madre en un volumen apropiado de cRPMI y una concentración de seis microgramos por mililitro.
Coloque el medio en un baño de agua a 37 grados centígrados. Luego use este medio para diluir una suspensión celular previamente preparada en una proporción de uno a uno para obtener de cinco a 6 millones de células por mililitro. A continuación, a una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos, agregue un mililitro de suspensión celular por pocillo por condición experimental.
Prepare una sola muestra de control teñida para Indo-1 libre de calcio agregando EGTA a las células cargadas con colorante Indo-1. Prepare un pozo para el control biológico negativo sin fluoróforos ni colorante Indo-1. Prepare un control positivo Indo-1 agregando ionomicina a una concentración de 50 micromoles a la suspensión celular cargada con colorante en el citómetro de flujo.
Además, prepare un pozo para controles de tinción única para poblaciones celulares adicionales utilizando fluoróforos conjugados con anticuerpos. Luego agregue dos microgramos de anticuerpo bloqueador del receptor FC por millón de células e incube la placa durante 45 minutos con golpecitos cada 15 minutos para resuspender las células. Después de la incubación, mezcle y retire todo el volumen de células de la placa y agréguelo a los tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros.
Centrifugar y decantar el sobrenadante. Una vez que las células se lavan con un mililitro de cRPMI precalentado, granular de nuevo y decantar el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de cRPMI e incubar cada tubo, dejando la parte superior del tubo ligeramente abierta para el intercambio de gases, lo que permite la desesterificación completa de los ésteres AM intracelulares.
A continuación, prepare una mezcla maestra de todos los anticuerpos conjugados de fluorocromo definidos por el usuario y agréguela a las células en reposo para obtener un mililitro del volumen celular. Después del reposo, pellet las células y lavar el pellet resuspendiendo en un mililitro de cRPMI enfriado a cuatro grados centígrados. Repita este paso y coloque los tubos sobre hielo.
Resuspender muestras individuales en 500 microlitros de cRPMI libre de rojo de fenol utilizando un tubo de flujo de poliestireno de cinco mililitros con una tapa. Para mantener la temperatura utilizando el análisis de flujo de calcio, prepare un baño de cuentas agregando cuentas de baño a un pequeño baño de agua y caliéntelo hasta 37 grados centígrados. Corte cuidadosamente un tubo de crónica de 50 mililitros por la mitad y deseche la parte superior del tubo.
Llene tres cuartas partes del tubo restante con cuentas de baño y permita que alcance los 37 grados centígrados en el baño de cuentas. Coloque el baño de cuentas cerca de un citómetro de flujo, junto con una rejilla de espuma de poliestireno para colocar el tubo. Antes del análisis en el citómetro de flujo, caliente los tubos individualmente a 37 grados centígrados durante siete minutos.
Inicie sesión en el software del citómetro de flujo y haga clic en la pestaña Biblioteca. Luego seleccione etiquetas fluorescentes para agregar Indo-1 unido al calcio e Indo-1 sin calcio. Luego seleccione láser UV en grupos de etiquetas fluorescentes y haga clic en agregar para agregar un nombre de etiqueta fluorescente.
Elija la excitación láser y la longitud de onda de emisión y, a continuación, haga clic en Guardar. Continúe con la configuración experimental. Haga clic en la pestaña Adquisición, Abrir/Crear un nuevo experimento y agregue las etiquetas fluorescentes deseadas al experimento.
Cree un grupo de referencia y un nuevo grupo de muestra para el experimento y etiquete ambos grupos. En la pestaña Adquisiciones, establezca los eventos para que se registren al máximo en 10 millones, deteniendo el volumen hasta el volumen máximo de 3000 microlitros y el tiempo de detención hasta el máximo de 36, 000 segundos. Adquiera controles de tinción única para anticuerpos conjugados definidos por el usuario incluidos en el panel multicolor y para el colorante funcional Indo-1.
Agregue 50 micromoles de ionomicina al control positivo y vórtice Indo-1 unido al calcio. Agregue el tubo de flujo a la placa de inyección de muestras y haga clic en Grabar. Luego agregue control negativo Indo-1 sin calcio al citómetro de flujo y haga clic en Grabar.
Desmezcle los controles de una sola mancha haciendo clic en el botón Desmezclar. Una vez que se complete la mezcla, cree gráficos secuenciales utilizando la hoja de trabajo sin mezclar, como SSC-A versus FSC-A, para eliminar los desechos de la muestra y SSC-A versus SSC-H para eliminar dobletes. Luego cree puertas haciendo clic en Tramar.
Agregue un gráfico a la hoja de cálculo y haga doble clic dentro de la puerta para crear una población cerrada río abajo. Continúe hasta que se contabilicen todas las poblaciones de interés. A continuación, caliente las muestras de control teñidas individuales previamente preparadas a 37 grados centígrados para el análisis secuencial.
Configure el software de citometría de flujo y ejecute DI en agua helada durante dos o tres minutos para garantizar la estabilidad fluídica del citómetro de flujo. Configure gráficos secuenciales en la hoja de cálculo sin mezclar creando puertas utilizando los botones de rectángulo poligonal o puerta de elipse para incluir la población de interés. Haga doble clic dentro de la puerta y cambie los parámetros de los ejes y y x a SSC-A frente a SSC-H.
Complete la definición de los parámetros del eje haciendo clic izquierdo en el eje. Cree una gráfica con SSC-A frente a la señal de tinte de viabilidad. Puerta de las células vivas que son negativas para la tinción de colorante de amina.
Las células vivas negativas para la tinción de muertos vivos se agruparán en la marca cero tanto en el eje y como en el eje x. Haga doble clic en la gráfica interior para crear una nueva gráfica que contenga solo linfocitos vivos de una sola célula. Cambie el eje Y a Indo-1 frente al tiempo en el eje x para visualizar la afluencia de calcio.
A continuación, coloque la muestra biológica calentada en la SIT de la máquina. Ejecute las muestras a 2, 500 a 3000 eventos por segundo en un caudal medio para visualizar la afluencia de calcio en un número limitado de poblaciones celulares. Agregue el siguiente tubo al baño de cuentas en el control de adquisición.
Presione Grabar para registrar los datos iniciales durante 30 segundos para obtener un nivel basal de señalización de calcio en la muestra. Luego haga clic en Detener y retire el tubo del puerto de inyección de muestra. Agregue 30 microgramos de anti-CD3 no conjugado directamente en el tubo de muestra para iniciar la afluencia de calcio.
Vuelva a colocar rápidamente el tubo en el puerto de inyección de la muestra y pulse Grabar en el software. Registre datos durante siete minutos, observando el tiempo transcurrido bajo los controles de adquisición en el software. A continuación, pulse Detener en el software.
Añadir un microgramo por mililitro de ionomicina y registrar durante 30 segundos para obtener la máxima señal de calcio en las células de interés. Continúe con la siguiente muestra y repita el flujo de trabajo hasta que se hayan recopilado todas las muestras. Guarde el experimento y haga clic en el archivo zip de exportación.
Los archivos sin mezclar se cargan en un software externo de análisis de citometría de flujo. Una señal consistente estable en un gráfico de tiempo versus dispersión lateral indicó estabilidad fluídica. La población de linfocitos fue cerrada seguida de discriminación de singletes en una gráfica de altura de dispersión lateral versus área.
Se evaluó la viabilidad de los singletes. Luego se aplicó gating en población CD19 negativa. Estos subconjuntos de células T se evaluaron utilizando anticuerpos contra CD4 y CD8 mediante la visualización de la fluorescencia Indo-1 unida al calcio frente al tiempo.
En poblaciones celulares individuales, la gráfica de Indo-1 unido al calcio versus el tiempo mostró una línea de base antes de la estimulación. Una respuesta máxima a medida que los niveles de calcio intracelular disminuyeron y la respuesta al calcio provocó la adición de ionomicina. Antes de la adición de anticuerpos anti-CD3, se detectó una señal débil de Indo-1 unida al calcio.
Durante la respuesta máxima, las células mostraron una fuerte señal de Indo-1 unida al calcio y una reducción de Indo-1 libre de calcio. A los cinco minutos después del pico, la fluorescencia Indo-1 casi volvió a la línea de base. Después de la adición de ionomicina, se visualizó una señal robusta de Indo-1 unido al calcio, lo que indica una carga de colorante adecuada de las células.
El análisis de las poblaciones raras se realizó trazando Indo-1 unido al calcio versus Indo-1 libre de calcio después de la activación de cada población de interés. Y analizar la respuesta del calcio durante todo el curso del tiempo para cada subconjunto. El flujo de calcio utilizando perfiles de espectro completo puede conducir a un análisis citométrico de flujo de alto parámetro en una variedad de subconjuntos inmunes.
El análisis de alta dimensión para la agrupación no sesgada de subconjuntos de células T se puede utilizar en combinación con citometría de flujo de alto parámetro para un análisis avanzado. Esta técnica se desarrolla para el análisis de múltiples subconjuntos inmunes en conjunto entre sí en una muestra a granel.
