Para empezar, obtenga una placa de cultivo con colonias de la especie LW13 de Methylomonas. Inocular las colonias en seis mililitros de medio de sales minerales de nitrato en un tubo de vidrio. Selle el tubo con un tapón de suero y un sello de engarce de aluminio.
Agregue metano con una jeringa para crear una atmósfera final de 50% en volumen de metano en el aire. Agite este cultivo líquido planctónico a 200 revoluciones por minuto a temperatura ambiente hasta que esté turbio, lo que tarda aproximadamente un día. Pase los cultivos líquidos en una proporción de uno a 10 a medios frescos.
Continuar cultivando los cultivos líquidos de metanótrofos hasta la fase de crecimiento logarítmico, alcanzando una densidad óptica a 600 nanómetros de aproximadamente 0,5. Para preparar la jeringa, retire los émbolos que la acompañan y colóquela en un recipiente estéril. Coloque una punta de filtro estéril de politetrafluoroetileno o PTFE en cada jeringa y coloque la jeringa en una gradilla estándar para tubos de ensayo con la punta hacia abajo.
Luego, mezcle un mililitro de las células con cinco mililitros de sales minerales de nitrato medio y cuatro mililitros de agarosa fundida en un tubo cónico estéril. Vierta lentamente la mezcla de agarosa en la jeringa hasta la marca de ocho mililitros y deje que se solidifique. Después de aproximadamente 15 minutos, tape la jeringa con un tapón de butilo de goma estéril de 20 milímetros.
Asegure los tapones con cinta de laboratorio y etiquete la jeringa. A continuación, llene una jeringa grande de 60 mililitros con 100% de metano y conecte una punta de filtro de PTFE conectada a una aguja estéril de calibre 23. Perfore el tapón de goma de la jeringa con la mezcla de agarosa con una jeringa grande e inserte una segunda aguja estéril como salida de gas.
Presione el émbolo de la jeringa grande para permitir que 20 mililitros de metano al 100% pasen por el espacio de la cabeza. Retire la aguja de salida cuando queden uno o dos mililitros de metano en la jeringa para evitar el reflujo de oxígeno. Incubar la jeringa con mezcla de agarosa y metano a 18 grados centígrados.
Para extruir la agarosa, reemplace la punta del filtro de PTFE con una aguja estéril de calibre 23 y el tapón de goma con el émbolo de jeringa suministrado. Presione lentamente el émbolo para dispensar incrementos de un mililitro en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros separados. La cepa LW13 de tipo salvaje formó una banda horizontal distinta a una profundidad específica en la jeringa de gradiente donde las concentraciones de metano y oxígeno eran bajas.
LW13 inoculado en jeringas de gradiente mostró un contragradiente de metano-oxígeno con depleción de metano y consumo de oxígeno correspondiente a la profundidad de la banda horizontal. El mutante de deleción OAT de LW13 carecía de la formación de banda horizontal distintiva observada en la cepa de tipo salvaje, lo que indica el papel del gen en este fenotipo.
