Para empezar, obtenga los segmentos de agarosa extruidos de jeringas de gradiente, inoculadas con especies de metilomonia de tipo salvaje o mutante, LW13. Añadir 0,75 mililitros de cloruro de sodio al 0,85% en agua a la muestra de agarosa extruida y homogeneizar por vórtice. Además, diluya la muestra 1 a 10 en un nuevo tubo de microcentrífuga con 900 microlitros de solución salina.
Incubar las muestras con tres microlitros de una mezcla uno a uno de SYTO 9 y manchas de yoduro de propidio en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para determinar las células por mililitro de agarosa, sonicar la suspensión de perlas de recuento de microesferas en un baño de agua durante cinco minutos. A continuación, añada 10 microlitros de la suspensión a la muestra antes del análisis por citometría de flujo.
Analice las muestras con un citómetro de flujo. Compare los diagramas de operación de dispersión lateral frente a dispersión directa entre muestras de control sin células y muestras de agarosa inoculadas para dibujar puertas de voltaje de eventos bacterianos que excluyan las partículas de agarosa de fondo. Para contar las unidades formadoras de colonias dentro de la jeringa de gradiente, agregue 800 microlitros de medio de sales minerales de nitrato al segmento de agarosa extruida y al vórtice durante 10 segundos para ayudar en el pipeteo.
Prepare una placa estéril de 96 pocillos con 180 microlitros de medio de sales minerales de nitrato en cada pocillo. Agregue 20 microlitros de muestra de agarosa diluida a cada pocillo en la primera columna y mezcle. Con una pipeta multicanal, diluya en serie 20 microlitros de muestras diez veces, empezando por la primera fila de pocillos.
Etiquete la placa de rejilla cuadrada que contiene sales minerales de nitrato, barrena o medio de su elección. Con una pipeta multicanal, detecte cinco microlitros desde una columna de la placa de 96 pocillos en la placa del sinfín. La citometría de flujo utilizando las muestras de agarosa extruida confirmó que el mutante de deleción OAT de LW13 mostró un crecimiento celular reducido en comparación con la cepa de tipo salvaje.
La complementación del mutante con el gen OAT restauró el número de células y la formación de bandas a niveles similares a los del tipo salvaje, lo que indica el papel específico del gen en la formación de bandas.
