Para comenzar, dividimos las semillas de nuestras células T HEK293 transfectadas en bucle en una placa de 96 pocillos recubierta de poli-D-lisina. A continuación, prepare tres soluciones frescas de Rhosin, Ehop-016 y ZCL278 en un Microfuge II de 1,7 mililitros. Agregue sustrato de células vivas para la renilla luciferasa, diluido de 1 a 2, 000, hasta una concentración final de 30 milimolares a cada solución. Para hacer soluciones de ZCL278 de 0,55 y 50 micromolares, realice diluciones en serie utilizando los 50 micromolares iniciales de ZCL278 en medios de cultivo.
A continuación, retire los medios de cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene las células transfectadas. Agregue 50 microlitros de la mezcla de medios químicos y sustrato a cada pocillo. Después de incubar las células durante una hora, dos horas o cinco horas, cargue la placa en el lector de placas de luminiscencia y mida la luminiscencia.
Asegúrese de que el lector de placas esté encendido antes de comenzar. Acceda al software Microplate Reader y haga clic en nueva sesión para crear un nuevo archivo. Haga clic en la incubadora para ajustar la temperatura del lector de placas a 37 grados centígrados.
Marque la opción de temperatura y escriba 37 grados centígrados. En Diseño de placa, elija la opción desconocido y haga clic y arrastre el pozo para especificar los pozos que se van a medir. Luego vaya a protocolo, haga clic en luminiscencia y mantenga la configuración predeterminada.
Una vez completada la configuración, cargue la placa sin tapa en el lector de placas y elija ejecutar la placa adentro. Haga clic en iniciar y aparecerá una ventana de guardar archivo. Cambie el nombre del archivo y haga clic en guardar.
Una vez completada la lectura, retire la placa del lector de placas y luego haga clic en la opción ejecutar placa en para volver a colocar el lector. Una vez completado, vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada hasta la próxima lectura. A la una, dos y cinco horas del tratamiento, las células tratadas con Rhosin no mostraron cambios significativos en la actividad de la luciferasa en comparación con las células de control tratadas con DMSO.
El inhibidor de la GTPasa Rac EHop-016 mostró una actividad de luciferasa significativamente menor que el DMSO. Las células tratadas con ZCL278 tuvieron una actividad de luciferasa significativamente menor que el DMSO de control en los tres puntos temporales. Las actividades de luciferasa medidas a una, dos y cinco horas después del tratamiento mostraron una respuesta dependiente de la dosis.
Las concentraciones más altas de ZCL278 aún mostraron cambios significativos en comparación con el DMSO de control.
