Este ensayo de sedimentación in vitro basado en concanavalina A está diseñado para medir la afinidad de unión de las fosfatasas de glucano contra diferentes sustratos de STA. La información que obtenemos de este método es fundamental para nuestra comprensión de la familia de enzimas glucano fosfatasa. Las interacciones de proteínas de carbohidratos son relativamente débiles, por lo tanto, los métodos actuales no pueden detectar las interacciones glucano fosfatasa y glucano.
Nuestro ensayo de cosedimentación basado en lectinas puede detectar la afinidad de unión en el rango milimolar. La caracterización de los mutantes SEX4, así como otros miembros de la familia de enzimas glucano fosfatasa demuestra la capacidad de este ensayo para cuantificar las interacciones de carbohidratos proteicos. Una de las partes más desafiantes del ensayo es optimizar el rango de concentración del sustrato.
Recomendamos comenzar con un rango más amplio para tener una idea y luego reducir para un rango específico. Para comenzar, pipetear 250 microlitros de suspensión de perlas de ConA-sepharose en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar el contenido a 10, 000 G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados.
Después de desechar el sobrenadante, agregue 750 microlitros del tampón de unión a cada tubo que contenga 250 microlitros de perlas de ConA-sefarosa. Centrifugar los tubos a 10, 000 G durante un minuto a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante. A continuación, prepare diluciones dobles de la solución de amilopectina solubilizada para hacer una serie de soluciones diluidas de amilopectina de dos mililitros.
Para preparar las perlas de Amilopectina ConA-sepharosa, agregue 250 microlitros de cada solución diluida de amilopectina a los tubos que contienen 250 microlitros de perlas de ConA-sepharose preequilibradas y tampón de unión. Mezclar bien el contenido y etiquetar los tubos con la concentración de amilopectina correspondiente. Incubar el contenido del tubo en una rueda giratoria a cuatro grados centígrados durante 30 minutos y centrifugar los tubos a 10, 000 G durante un minuto.
Mezcle 250 microlitros de perlas de Amilodectina ConA-sefarosa con 100 microlitros del tampón de unión que contiene 10 microgramos de exceso de almidón cuatro, o proteína SEX4, 10 milimolares de ditiothreitol y 10 micromolares de cóctel inhibidor de proteasa. Incubar el contenido a cuatro grados centígrados durante 45 minutos con una rotación suave. Luego centrifugar los tubos a 10, 000 G durante un minuto y cuidadosamente pipetear 50 microlitros del sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros.
Agregue 20 microlitros de colorante de página 4X SDS y 10 microlitros de agua destilada a cada tubo que contenga 50 microlitros de las fracciones sobrenadantes recolectadas y etiquételas como S.Del mismo modo, agregue 20 microlitros de colorante de página 4X SDS y 80 microlitros de agua destilada en los tubos que contienen perlas de ConA-sepharose amilopectina SEX4 lavadas. Después de agregar el tinte y el agua, caliente todas las muestras a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Una vez que las perlas de ConA-sepharose amilopectina SEX4 se centrifugan a 10, 000 G durante un minuto, guarde el sobrenadante y etiquételo como P.Cargue 40 microlitros de las muestras de proteínas no unidas etiquetadas como S en pocillos de gel de poliacrilamida prefabricados de 4 a 12% desde la concentración de sustrato más baja hasta la más alta, reservando el primer carril para un marcador de peso molecular de proteína.
Use un segundo gel para cargar las muestras de proteína unidas a glucano etiquetadas P.Agregue un tampón de ejecución de la página SDS recién preparada a ambas cámaras del aparato y ejecute el gel a 150 voltios durante 35 minutos o hasta que el frente del tinte llegue al fondo del gel. Luego tome el casete de gel del aparato y retire los espaciadores y las placas de vidrio para separar el gel para el análisis de Western blot. Haga un litro de tampón de transferencia que contenga 5.8 gramos de tris base, 2.9 gramos de glicina, 0.37 gramos de SDS y 200 mililitros de metanol.
Para transferir las proteínas separadas por tamaño del gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa, ensamble las esponjas, los papeles de filtro, el gel y la membrana de nitrocelulosa de acuerdo con el protocolo de transferencia occidental y funcione a 70 voltios durante una hora. Después de ejecutar el gel, incubar la membrana de nitrocelulosa en una solución de proteína de albúmina sérica bovina al 1 a 5% o proteína de leche en 50 mililitros de tampón TBST durante una hora para evitar la unión de proteínas no específicas. Lave la membrana tres veces con tampón TBST para eliminar cualquier solución bloqueante no unida.
A continuación, incubar la membrana durante una hora con el anticuerpo diluido ligado a la peroxidasa de rábano picante específico para la proteína marcada con histidina. Luego lave la membrana tres veces en tampón TBST para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Para imágenes digitales, haga una solución de partes iguales de soluciones de sustrato quimioluminiscente, 750 microlitros cada uno en un tubo de 1.5 mililitros, e incube la membrana durante al menos cinco minutos en la solución.
Coloque la proteína de membrana hacia abajo en el escáner de borrones y ejecute el software de adquisición para cuantificar la proteína tanto en la fracción de pellet como en la de sobrenadante. Para adquirir los datos, inicie las mediciones cuantitativas de la señal utilizando el software de adquisición con el escáner de borrones. Normalizar todas las mediciones cuantitativas en las fracciones sobrenadante y pellet a la proteína total cargada.
En el experimento de unión de saturación, trace el porcentaje de concentración de proteína unida frente a la amilopectina y ajuste los datos utilizando un software de análisis de datos para calcular la constante de disociación, Kd.La capacidad de unión de SEX4 a las perlas de amilopectina ConA-sefarosa se analizó utilizando la página SDS. Se observó la presencia de proteína SEX4 en la fracción de pellets y albúmina sérica bovina en la fracción sobrenadante. W278A, un mutante SEX4 conocido con una capacidad de unión de glucano significativamente reducida, apareció en la fracción sobrenadante, lo que indica la utilidad y especificidad de este ensayo.
El análisis Western blotting reveló un aumento significativo en la detección de SEX4 y el método es específico para detectar fosfatos de glucano con una etiqueta de histidina terminal terminal. El ensayo de cosedimentación se probó a tres concentraciones diferentes de SEX4. Mientras que dos microgramos de SEX4 son suficientes para visualizar a través de la detección de quimioluminiscencia, el uso de cinco o 10 microgramos de SEX4 permite una detección más precisa.
Además, se observó un aumento de la unión a SEX4 con un aumento de la concentración de amilopectina. Se determinó la afinidad de unión de la amilopectina y la proteína de tipo salvaje SEX4 a diferentes concentraciones y los datos de porcentaje de proteína unida al modelo específico de unión a un sitio dieron un Kd de aproximadamente 1,03 miligramos por mililitro. Se evaluó la aplicabilidad de este método para medir la unión de laforina, LSF2, SEX4 de maíz y SEX4 de papa contra amilopectina de papa.
Los resultados demostraron que las proteínas probadas de cultivos agronómicamente importantes también se unen diferencialmente a la amilopectina. Es crucial recordar la normalización de todas las mediciones cuantitativas en las fracciones de pellet y sobrenadante a la proteína total cargada. Para asegurarse de que toda la amilopectina esté unida a las perlas, guarde las fracciones sobrenadantes para realizar el ensayo de glucosa profunda más tarde.
La glucano fosfatasa emplea distintos mecanismos para unir, localizar y desfosforilar carbohidratos. Este método permite la exploración de la unión de la fosfatasa de glucano a diferentes dominios estructurales dentro de grandes complejos poliméricos para la desfosforilación específica de la posición.
