Para comenzar, cubra las placas de 24 pocillos con la solución de recubrimiento e incube durante dos horas a 37 grados centígrados, o toda la noche a temperatura ambiente. Lave las placas dos veces con agua estéril y guárdelas a temperatura ambiente hasta que las celdas estén listas para enchapar. Ahora tome una sección del yeyuno de caballo y colóquela en una solución fría de timbre sobre hielo.
Retire una porción de 10 centímetros del yeyuno y ábrala en el borde antimesentérico, colocando las regiones no linfoides en el centro. A continuación, recorte la porción en una sección de aproximadamente siete por siete centímetros y enjuague bien el tejido con una solución de timbre fresca antes de la disección. Ahora sujete el tejido con alfileres en una placa de Petri recubierta de elastómero de silicona en una solución de timbre fría, o PBS, con el lado de la mucosa hacia arriba, mientras lo estira tanto como sea posible.
Con pinzas curvas, extirpe las vellosidades intestinales y luego retire la capa de lámina propia de aproximadamente cinco por cinco centímetros de la región no linfoide. A continuación, con unas tijeras de microdisección, retira la submucosa de una hoja liberándola por una esquina. Observe la separación natural mientras se retira la submucosa de la capa muscular circular interna.
A continuación, pica la capa submucosa recogida en trozos de dos a cinco milímetros. Colóquelos en un tubo cónico de 50 mililitros, que contiene cinco mililitros de orgono sin FBS, colagenasa, proteasa y BSA. Incubar el tejido durante dos o tres horas a 37 grados centígrados para la digestión enzimática.
Después de la incubación, agregue 10 mililitros de orgono a temperatura ambiente con FBS para detener la acción de la enzima. Pipetear la mezcla de tejido hacia arriba y hacia abajo 15 veces con una pipeta serológica de 10 mililitros para disociar las células del tejido. A continuación, centrifugar la mezcla a 3000 G durante tres minutos a temperatura ambiente.
A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de PBS a temperatura ambiente pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo 15 veces con una pipeta serológica de 10 mililitros. Centrifugar el tubo cónico a 3000 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de orgono a temperatura ambiente con FBS pipeteando hacia arriba y hacia abajo 15 veces.
A continuación, filtre las células secuencialmente a través de un filtro celular de tamaño de poro de 100, 70 micrómetros y 40 micrómetros. Después de centrifugar las células y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de orgono con FBS. A continuación, tiñe las células con azul de tripán para identificar las células vivas y contarlas con un hemocitómetro.
Ahora siembra aproximadamente 400.000 células en 300 microlitros de orgono con FBS en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Agregue cinco microlitros de N2, cinco microlitros de G5 y 10 microlitros de B27 a cada pocillo. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono para permitir la adhesión celular.
Cuando las células del primer paso alcancen una confluencia del 70 al 80%, exponga los pocillos a cero, 10 y 25 nanogramos de interleucina-1 beta durante 24 horas. En los cultivos se observaron células fusiformes consistentes con morfología glial entérica, con pleomorfismo y mínima contaminación de otros tipos de células.
