This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Política de Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio establecidos por la Oficina de Laboratorio Animal Welfare (NIH) y sólo con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Connecticut Health Center. 1 Preparación de mezcla de culturas gliales <ol><li> Esterilice todos los instrumentos antes de su uso. Añadir 3 ml de solución enfriada con hielo estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) que no contiene cationes (Mg2 + o Ca2 +) a tres estériles 60 mm placas de Petri mantenidas en hielo para mantener frío. </li><li> Aislar las cortezas de postnatales crías de ratón P0-P2, como se describió previamente 17,18. NOTA: las estructuras subcorticales, como el hipocampo, no están incluidos en estas culturas. </li><li> Retire con cuidado las meninges y luego transferir las cortezas aisladas al fresco HBSS y disociar los tejidos enzimáticamente, usando un nekit de disección de tejido ural de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Placa de las células en frascos estériles T-175 e incubar durante la noche en medios de comunicación [medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS) que contiene 1x penicilina / estreptomicina]. </li><li> Vuelva a colocar todos los medios de comunicación al día siguiente con medio fresco. Continuar incubar culturas, con cambios regulares de los medios de comunicación, por aproximadamente 3 semanas o hasta que se establezca una monocapa celular. NOTA: Esta monocapa estará compuesto por astrocitos y microglia con un aproximadamente 10: 1 19. </li></ol> 2. globoides inducción celular en cultivos mixtos gliales <ol><li> Preparar los cubreobjetos ECM-revestido. <ol><li> Remojar cubreobjetos circulares con 1 N de ácido estéril clorhídrico (HCl) en una placa de Petri estéril durante 30 min. Lavar 3x cubreobjetos con agua estéril y luego sumergirse en EtOH al 95% durante al menos 20 min. y luego dejar que se seque al aire. </li><li> Coloque las gotas de matr extracelular diluidomateriales ix (ECM) de recubrimiento proteína en una hoja de Parafilm (por ejemplo, 150-250 l / gotita de laminina 10 mg / ml disuelto en solución tampón de fosfato estéril [PBS]). Distribuir las gotas para que cubreobjetos no tocar cuando se coloca en estas gotitas. Coloque con cuidado cada cubreobjetos secos sobre una gotita con fórceps. </li><li> Deja los cubreobjetos sobre las gotas para aprox. 4-6 horas dentro de la campana de cultivo con la hoja cerrada. </li><li> Coloque el cubreobjetos recubiertos (ECM ECM laterales recubiertos de arriba) en cada uno de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Lavar cada pocillo con PBS estéril 3x y mantener a 4 ° C hasta que se necesite. </li></ol></li><li> Preparación de células gliales para Plating en cubreobjetos. <ol><li> Aspirar los medios de comunicación de las culturas gliales y lavar suavemente los 3x monocapa gliales con 10 ml de PBS estéril. A continuación, agregue ml de solución de tripsina-EDTA 8-10 a la T-175, y se incuba durante 5-10 minutos a 37 ° C. </li><li> Cuando la mayoría de la monocapa se ha separado, añadir 20 ml de medio completoal matraz para detener la tripsinización. Recoger los medios que contienen las células separadas en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar durante 10 min a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento, y luego volver a suspender las células en 2 ml de medio completo fresco pipeteando suavemente la solución con una pipeta P1000. </li><li> Determinar el número de células usando un hemocitómetro y luego volver a suspender las células en medio completo a la densidad deseada (por ejemplo, 10 5 células / ml). Placa de las células sobre los cubreobjetos recubiertos con ECM (por ejemplo, 500 l en cada pocillo de la placa de 24 pocillos). Añadir medio completo fresco adicional a cada pocillo durante 3-5 días de incubación a 37 ° C, o hasta que las células crecen hasta la confluencia visual deseado. </li></ol></li><li> El tratamiento con psicosina. <ol><li> Reconstituir el psicosina a una concentración de reserva (108,3 mM) en dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir esta población en EtOH al 100% para hacer una reserva de trabajo que puede eln ser añadido en cada pocillo de placa de 24 pocillos para conseguir una concentración final de 10 mM. </li><li> En el momento de añadir el psicosina, agitar suavemente la placa de cultivo para mezclar el psicosina en medios de cultivo. Complementar la psicosina añadiendo el equivalente de 10 mM cada dos días durante una semana. </li></ol></li><li> Después de 7 días de tratamiento psicosina, recoger los medios de comunicación y de pipeta 500 l de frío 4% de paraformaldehído (PFA) en cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min para fijar las células. A continuación, lavar cada pocillo 3 veces con PBS y luego mantener las placas a 4 ° C hasta su procesamiento para inmunocitoquímica (ver más abajo). NOTA: medios de cultivo celular puede ser recogido para enzimático o ensayo ELISA en este punto, si se desea. </li></ol> 3. inmunocitoquímica (CPI) para visualizar las células globosas <ol><li> Reemplazar PBS con tampón de bloqueo [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% de suero normal de cabra (NGS)], e incubar las células durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> EnCubate las células fijadas en antisueros primaria contra Iba-1 [(1: 1000) diluido en PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] durante al menos 1 hora a temperatura ambiente, luego lavar cada pocillo con PBS 3x 5 min / lavar. </li><li> Añadir el anticuerpo secundario conjugado de fluorescencia correspondiente para identificar el anticuerpo etiquetado y la contra-tinción primaria con 4 &#39;, 6-diamino-2-fenilindol (DAPI, 1: 1000) para identificar los núcleos. Incubar en solución de anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar con PBS 3x 5 min. </li><li> Montar cada cubreobjetos a portaobjetos de microscopio utilizando un medio de montaje. Ver diapositivas en un microscopio de fluorescencia para los análisis visuales y cuantitativos. </li></ol> 4. Análisis y caracterización de las células en cultivo primario globoid <ol><li> Utilice los siguientes tres criterios morfológicos para identificar una célula globosas en la cultura: <ol><li> Identificar células globoides utilizando microscopía de fluorescencia, mediante el etiquetado immunopositive para el marcador microglial, Iba-1 +. </li><li> Identificarcélulas globoides como polinucleadas (es decir, que contienen dos o más núcleos positivos DAPI). </li><li> Identificar células globoides por una morfología redondeada distinta de la apariencia altamente ramificado de descansar células microgliales. NOTA: Las células también pueden ser recogidas para análisis de marcadores de la superficie celular y cuantificación por citometría de flujo de estos cultivos. </li></ol></li><li> La medición de la activación de la microglía fagocítica y células globoides <ol><li> Para evaluar la actividad fagocítica de microglia psicosina tratados, añadir perlas de látex marcadas con FITC a los pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir perlas de látex fluorescentes conjugados 48 horas antes de la fijación con PFA. Fijar las células tratadas con los granos (como se mencionó en la sección 2.4), y el proceso para inmunocitoquímica (como se describe en la sección 3). </li><li> Seleccionar anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado de modo que no se superponen los espectros de emisión de fluorescencia de las perlas de fluoróforo marcado. </li><li> Analyze los perfiles phagocytotic de Iba-1 + microglia mediante la identificación de las células que co-localizar con las cuentas marcadas con fluorescencia. NOTA: psicosina se activará microglia. Perlas fagocitados serán identificados dentro de Iba-1 + células mononucleadas y multinucleadas en esta configuración cultura. </li></ol></li></ol> 5. inducción de células globosas de cultivos purificados microgliales NOTA: Un enfoque alternativo para descifrar la señalización intercelular entre el astrocitos y microglia es otra ventaja de este modelo de células in vitro globoid en. La purificación de las células microgliales primarias para replating o co-cultivo se puede lograr mediante su propiedad menor adhesión en la cultura, tal como se describe en los siguientes pasos (ver Sección 5.2). <ol><li> Reunir los medios de comunicación de los confluentes mezcla de culturas gliales en 50 ml tubo cónico y mantenerla a 37 ° C en la incubadora. </li><li> Aislamiento Microglial de mezcla de culturas gliales primarios.<ol><li> Después de extraer el soporte de un frasco mixta confluente T175 cultura glial, añadir medios temblorosas cálidos [consistentes en medio completo + 25 mM de 4 (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) + 25 mM de bicarbonato de sodio (Sigma)]. Agitar los frascos de 3-4 horas en un agitador orbital a 100 rpm (37 ° C). Recoge los medios de estos matraces sacudidos en 50 ml tubos cónicos. NOTA: Este material debe incluir la microglia menos adherente de los frascos. </li><li> Haga girar los medios de comunicación a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 2 ml de los medios de comunicación de los astrocitos acondicionado (recogido en el paso 5.1). </li><li> Establecer el número de células adquirida usando un hemocitómetro y luego la placa de las células microgliales en cubreobjetos sustrato recubierto (ver sección 2.1) para inmunocitoquímica, o placa sobre placas de pocillos adherencia ultrabajo para la futura colección de células globoides para co-cultivo con otros tipos de células, tales como oligodendrocitos (como descRibed en la siguiente sección). NOTA: Una vez adherido la microglia se puede tratar con psicosina (10 M) como se describe anteriormente (ver sección 2.3). </li></ol></li><li> Co-cultivo con oligodendrocitos primarios para el análisis de citotoxicidad. NOTA: Colección de psicosina tratados con microglia de las placas de adherencia bajas para co-cultivo posterior en cultivos primarios de oligodendrocitos o células progenitoras de oligodendrocitos, se puede utilizar para examinar el potencial función citotóxica de estas células globosas-como in vitro. <ol><li> Desarrollar cultivos de oligodendrocitos primarios utilizando métodos establecidos 18,20. Para recoger la microglia psicosina tratados, pipetear suavemente para desprender las células poco adherentes desde el fondo de los pocillos. Recoger las células, centrifugar a 300 xg durante 10 min, y luego resuspender cuidadosamente en medio de diferenciación de oligodendrocitos [compuesto por los medios de comunicación Neurobasal, L-glutamina (1x), B-27 suplemento (1x), y triyodotironina (T3, 10 ng / ml )]. </li><li> Contar el número de células utilizando un hemocitómetro y luego sembrar las microglia en el cultivo de oligodendrocitos a 1 x 10 5 células / ml, resultando en un aproximado 1: 2 relación microglia / oligodendrocitos. Incubar como un co-cultivo por hasta 3 días. </li><li> Fijar las células para inmunocitoquímica (ver sección 2.4). Reunir los medios de cultivo celular para ELISA o análisis químicos según sea necesario. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

El protocolo descrito en el presente documento proporciona un nuevo sistema modelo para estudiar el desarrollo y la caracterización funcional de microglia activadas y células globoides. Antes de trabajo por Im et al. utilizando una línea celular HEK293 proporciona un modelo para el desarrollo del presente protocolo para el estudio de la formación de células globosas 21. También es importante señalar que las células globoides derivados en el modelo se diferencian de las células globoides nati...

Leucodistrofia de células globoides (GLD), también conocida como enfermedad de Krabbe, es una enfermedad desmielinizante fatal resultante de la pérdida de mutaciones de función en el galatocerebrosidase (GALC) gen 1. La forma más frecuente de GLD es la variante infantil, que se caracteriza por un inicio en la primera infancia y se caracteriza por un curso clínico agresivo del motor y el deterioro cognitivo que conduce a la muerte prematura a menudo antes de los cinco años de edad 2,3. Las pruebas genéticas se utiliza para verificar el diagnóstico de GLD 4. Neuropatología de GLD revela desmielinización generalizada, atrofia neuronal, astrogliosis y presencia de microglia multi-nucleadas llena de sangre llamadas células globoides 5-7. La identificación de células globoides, que a menudo contienen inclusiones tubulous en su citoplasma, ha sido una característica definitoria de GLD durante los últimos 97 años, aunque la función específica de estas células conspicuos ha permanecido esquivo. La participación de los no-Myelginarios gliales (astrocitos y microglia) en la patogénesis de GLD ha sido considerado una respuesta secundaria a la profunda desmielinización en esta enfermedad 8. Curiosamente, la primera descripción de esta enfermedad, hecho por Knud Krabbe en 1916 5, la formación informado de los fagocitos multinucleadas que contienen restos de lípidos que se han llamado &#39;globoides células&#39; y son una característica definitoria de esta enfermedad. Células globosas son el rasgo distintivo de GLD patología, aunque su papel en GLD mucho tiempo se ha ignorado. Curiosamente, estas células se encuentran entre los primeros cambios característicos en el tejido del SNC de GLD. Esta falta de conocimiento puede haber sido debido a la suposición de que la formación de los fagocitos multinucleadas, llamadas células gigantes en otras enfermedades, se considera típicamente como consecuencia de la patología y no una fuerza impulsora patogénico inicial 9. Por lo tanto, ha habido pocos estudios que investigan el mecanismo por el whicélulas globoides ch se forman a partir de los fagocitos, particularmente en el SNC de GLD. El procedimiento descrito en este informe se centra en la importancia de la formación de células globosas en el SNC y nuestra demostración previa de que multinucleación inducida psicosina de microglia in vitro y estas células mostraron niveles más altos de actividad fagocítica. Consistente con estas observaciones, las células globoides en los cerebros twitcher frecuentemente contienen restos PAS positivo, lo que sugiere altos niveles de actividad fagocítica. Células globosas también se encuentran para ser immunopositive de ferritina (un marcador de microglia) 10, KP-1 / CD68 (un marcador de monocitos), y algunos son también positivas para vimentina (una proteína intermedia de filamento y el marcador de astrocitos y microglia activada) 11, HLA-DRa (un receptor de la superficie MHCII), y TNF-α 7, y Iba-1 (una proteína de unión de calcio utilizado para identificar microglia) 12. Sobre la base de esta colección de marcadores, las células globoides originan a partir de microglia que se desarrollanun fenotipo único. A pesar de su singularidad, la función y la contribución de los GC a GLD patogénesis específica ha sido pasado por alto. Células globosas se han pensado para ser una consecuencia secundaria de la desmielinización crónica. Sin embargo, estudios anteriores que examinaron la asociación temporal de células globoides a la patología de la materia blanca del GLD han identificado la presencia de células globoides a finales de embriones para el periodo posnatal temprana; tiempos anteriores apoptosis de los oligodendrocitos y desmielinización abierta 13. Por lo tanto, la secuencia temporal de desarrollo de la neuropatología en GLD sugiere que las células globoides se forman antes de desmielinización en esta enfermedad 14. Esto condujo a la hipótesis de que la formación temprana de células globoides en GLD puede representar un acontecimiento patogénico definir en lugar de una respuesta reactiva secundaria a daño de oligodendrocitos 15. Además, la desregulación de la actividad microglial en GLD se ha considerado un factor limitar la eficacia a largo plazo de las terapias de células madre hematopeotic para el tratamiento de esta enfermedad 16. Por lo tanto, se espera que la investigación de las funciones celulares y la regulación de la microglia y células globoides, en respuesta a psicosina para proporcionar nuevos conocimientos en la patogénesis de GLD. Hasta hace poco, la falta de un modelo apropiado para estudiar la formación de células globosas había limitado la comprensión de la función precisa y la contribución de estas células a la patología de GLD. En estudios recientes, se determinó que las células globoides-como se pueden formar en respuesta directa a psicosina, una toxina de lípidos patógena que se acumula en GLD. Encontramos que la microglia, pero no los macrófagos, se activan y se transforman en células globoides en cultivos gliales primarios en respuesta a psicosina 15. Esta transformación en células globoides se encontró que es mediado por la proteasa extracelular, metaloproteinasa de matriz (MMP) -3 15. Más recientemente, hemoshan ampliado estos hallazgos y determinó que las células de la microglia y globoides psicosina activado desarrollados en este sistema modelo in vitro en son potencialmente tóxicos para los oligodendrocitos y las células progenitoras de oligodendrocitos. Por lo tanto, cuando se considera en el contexto de GLD, la acumulación temprana de psicosina y la formación de células globoides anteriores a la desmielinización apoyaría un papel primario y posiblemente patógena emergente para la microglia en esta enfermedad. Proponemos que el estudio de la formación de células globosas revelará nueva información acerca de la patogénesis de la División de Asuntos Jurídicos, que contribuirá a nuestra comprensión de esta enfermedad. Por otra parte, este nuevo modelo celular de GLD puede proporcionar un nuevo formato de la que nuevos enfoques terapéuticos para abordar los cambios patológicos en la enfermedad podrían ser probados. Por lo tanto, en este informe se proporciona un protocolo detallado para el desarrollo in vitro de células globoides inducida psicosina-de cultivos primarios de células gliales no mielinizantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:500px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Life technologies</td>
			<td style="width:87px;">14175-095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-628</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 uM cell-strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25299-056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Psychosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9256</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19208</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iba-1</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor conjugated antisera</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Media</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>OB100-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phagocytic Assay Kit</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>500290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP310-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

La función precisa de la microglia multi-nucleado, llamadas células globoides, que son únicamente abundantes en el sistema nervioso central de leucodistrofia de células globoides (GLD) no está clara. Esta brecha en el conocimiento se ha visto obstaculizado por la falta de un adecuado modelo in vitro para el estudio. Aquí se describe un sistema de cultivo glial murino primaria en el que el tratamiento con resultados psicosina en multinucleación de microglia se asemejan a las células globoides característicos encontrados en GLD. El uso de este novedoso sistema, se definieron las condiciones y modos de análisis para el estudio de las células globoides. El uso potencial de este sistema modelo fue validado en nuestro estudio anterior, que identificó un posible papel de metaloproteinasas de matriz (MMP) -3 en GLD. Este novedoso sistema in vitro puede ser un modelo útil para estudiar la formación y función, sino también el potencial manipulación terapéutica, de estas células únicas.

Este protocolo, como está escrito, se espera que tome aproximadamente 36 días para completar de principio a fin (Ver Figura 1: Esquema de flujo de trabajo experimental). Ha sido nuestra experiencia que el desarrollo de células globosas-como &quot;en este sistema de cultivo primario es a la vez fiable y reproducible: la formación de células multinucleadas en respuesta a psicosina se observó consistentemente con 7 días de tratamiento. La tinción inmunocitoquímica de m...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K vistas.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

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An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Un aplastamiento del nervio óptico Lesiones modelo murino para estudiar la supervivencia de células ganglionares retinianas

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Investigación

Neurociencias

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como<em&gt; In Vitro</em&gt; Barrera hematoencefálica modelo

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

En Vitro Modelado de canceroso Neural Invasion: Modelo del ganglio de la raíz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...