Name: in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System at JoVE.com

This work was supported by grants from the Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (to B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women&#8217;s Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) and start-up funds from Michigan State University (B. Gulbransen).

NOTA: Los siguientes procedimientos que afectan el tejido de los animales de laboratorio son consistentes con las Directrices AVMA para la Eutanasia de los Animales de 2013 y fueron aprobados previamente por la Universidad Estatal de Michigan IACUC. 1. Preparación del tejido <ol><li> Anestesiar a la investigación con animales en una cámara que contiene 2,5% de isoflurano en oxígeno o mediante la colocación de 3-5 ml de isoflurano líquido sobre un material absorbente en el suelo de la cámara, asegurando que una barrera física impide que los animales del contacto directo con el isoflurano. Prueba para la profundidad de la anestesia por pellizcar la almohadilla de la pata. NOTA: La profundidad de la anestesia se considera apropiado cuando no hay reflejo de retirada de la extremidad posterior. Una vez anestesiado apropiadamente, la eutanasia el ratón por dislocación cervical </li><li> Colocar el animal en posición supina y limpiar la piel abdominal con etanol al 70%. El uso de fórceps para pellizcar la piel abdominal en la línea media y el uso de tijeras quirúrgicas para realizar una media de 6 cml incisión a lo largo de la línea alba para exponer los órganos digestivos internos. </li><li> El uso de fórceps romos para localizar y exponer el íleon dentro del peritoneo. Cortar el mesenterio del íleon / colon con tijeras y comenzar desentrañar el intestino. </li><li> Una vez que la longitud del intestino se deshizo adecuadamente, cortar el intestino distal al estómago y proximal al ciego para una preparación de íleon. Para una preparación de intestino grueso, cortar el distal del colon hasta el ciego y proximal al recto. </li><li> Quite rápidamente el segmento intestinal y colocarlo en un vaso con medio DMEM / F12 suplementado con hidrocloruro de nicardipina 3 M y 1 mM de clorhidrato escopolamina (en adelante, &quot;los medios de comunicación&quot;) en hielo. La adición de estos inhibidores facilita microdisección y la imagen posterior al paralizar el músculo liso intestinal. </li><li> Segmento de corte de interés (por ejemplo, yeyuno, íleon, colon distal o proximal) basado en marcadores anatómicos establecidos. Normalmente utilize tejido del íleon distal o en el colon distal. Sin embargo, utilizar el mismo procedimiento básico para aislar, de carga y de imagen neuronas y glía mientéricas en todas las regiones intestinales. </li><li> Retirar un pequeño segmento (6.4 cm) del segmento de intestino deseada y colocar en una placa de Petri con recubrimiento de Sylgard lleno de medios refrigerados. </li><li> Asegure los extremos proximal y distal del segmento intestinal con alfileres de insectos y abrir el tubo intestinal haciendo una recta, a lo largo corte a lo largo del borde mesentérico. </li><li> Tejido Pin plana bajo una ligera tensión con la cara mucosa y cuidadosamente diseccionar capa mucosa utilizando unas pinzas finas (# 5 y # 5/45 trabajo mejor) y tijeras muy finas de primavera. NOTA: La eliminación de la mucosa puede ser muy traumático para la ENS si no se hace correctamente. Para las preparaciones de calidad, tener cuidado de limitar retirada brusca de la mucosa por descamación o raspado. La mejor práctica es levantar la mucosa y cortar debajo con tijeras finas. </li><li> Cortar el tejido en preparación menors (aproximadamente 0,5 cm 2) y el pin en platos de imagen (4 esquinas con capa muscular circular hacia arriba) se coloca en el hielo con medio fresco. </li><li> Diseccionar cuidadosamente lejos músculo circular por las burlas aparte con pinzas finas para exponer el plexo mientérico. Evite estirar excesivo. </li><li> Coloque el plato de imágenes de nuevo en solución de hielo y el cambio por medio fresco. </li><li> Preparar 2 ml de mezcla de enzimas por plato [dispasa 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), colagenasa Tipo II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) en los medios de comunicación]. </li><li> Sacar los recipientes de hielo y agregue la mezcla de enzimas del paso 1.13. </li><li> Incubar platos a TA durante 15 min con 5% de CO 2/95% de aire. </li><li> Preparaciones de tejidos de lavado con medios 3 veces y esquinas re-pin. </li></ol> 2. Carga Fluo-4 Tinte NOTA: Evite fotoblanqueo trabajando con luz limitada durante la manipulación de los tintes fluorescentes y tejido cargadas de tintes indicadores. <ol><li> Preparar 4 mM solución de carga de Fluo-4. <ol><li> Añadir 1,5 ml de medio y 1,2 l de una acción probenecid 250 mM a una alícuota de 1,5 l de 4 mM Fluo-4 stock. 4 mM Fluo-4 stock se prepara mediante la adición de 11,4 l de Pluronic F-127 (20% en DMSO; suplementado con 0,25% Cremaphor-EL) a 50 g de Fluo-4, AM. </li></ol></li><li> Incubar preparaciones en Fluo-4 solución de carga durante 45 minutos en una incubadora oscura a 37 ° C. </li><li> Eliminar de la incubadora y lavar las preparaciones con los medios de comunicación 3 veces. </li><li> Medios de cambio de medio que contenía 200 mM probenecid e incubar 15 min a 37 ° C antes de formación de imágenes. NOTA: El probenecid es un fármaco que inhibe transportistas resistencia a múltiples fármacos en las neuronas. La adición de este fármaco inhibe la capacidad de las neuronas para extruir tintes y mejora etiquetado neuronal. Carga masiva de Ca 2+ colorantes indicadores en ausencia de probenecid produce carga celular principalmente glial. La adición de probenecid permite la visualización de las respuestas neuronales y gliales. </li><li> Preparar Modificado Krebuffer de bs. <ol><li> Hacer un tampón de Krebs modificada de tal manera que las concentraciones finales (en mm) de los componentes son como sigue: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, 1 pirúvico ácido y 8 de glucosa (pH ajustado a 7,4 con NaOH). Añadir 3 nicardipina mu M y 1 mM escopolamina para inhibir las contracciones musculares durante Ca 2 + de imágenes y todo el montaje disecciones. </li></ol></li></ol> 3. Imagen y Análisis NOTA: Utilice por lo menos un equipo básico de imágenes con una fuente de luz fluorescente, microscopio, una cámara CCD calidad y software de adquisición correspondiente. Varíe la adición de otros componentes en función de la fuente de luz y aplicación específica. Una rueda de filtro y de obturación deben usarse con una fuente de luz de arco de xenón tradicional. Sin embargo, fuentes de luz LED y sistemas de iluminación no requieren esos componentes. <ol><li> Coloque el recording cámara bajo el microscopio y el uso de un sistema de perfusión de flujo por gravedad con múltiples depósitos de jeringa con calefacción establecer una velocidad de perfusión continua de 2-3 ml / min de 37 ° C tampón Krebs. Asegúrese de que para evitar la formación de burbujas de aire, tanto en la línea de entrada y de succión conectado a una trampa de vacío. </li><li> Traiga el plexo deseados en foco bajo iluminación de campo brillante. Evitar la sobreexposición de los tejidos, que puede conducir a la foto de blanqueo. </li><li> Examine el Fluo-4 carga dentro de los ganglios y seleccione ganglios saludable para la imagen. Ganglios poco saludables / dañados exhibirán autofluorescencia o puntiforme morfología y no deben ser utilizados para la imagen. </li><li> Una vez que se selecciona ganglio, desviar la trayectoria de la luz a la cámara y obtener imágenes en vivo con el software de adquisición de imágenes. Asegúrese de que ganglio está en enfocar y ajustar la tasa de adquisición de imágenes y los tiempos de exposición. NOTA: las tasas de adquisición de la imagen y los tiempos pueden variar dependiendo de los eventos investigadores desean grabar. Para la mayoría de experimentos, las imágenestradicionalmente adquiridos en 0,5 a 1 Hz para las células gliales y hasta 2-10 Hz para las neuronas porque las respuestas glial Ca 2 + no son tan rápidos como Ca 2 + transitorios en las neuronas. </li><li> Comience experimento y establecer actividad de referencia durante 30 segundos. </li><li> Aplicar drogas pre-calentado de interés, tales como agonistas y antagonistas del receptor utilizando el sistema de perfusión de flujo por gravedad a una velocidad de 2-3 ml / min. Siga aplicación de agonistas / antagonistas volviendo a una perfusión de tampón normal y permitir un período de lavado / recuperación de al menos 10 min. NOTA: Los tiempos de aplicación del fármaco variará dependiendo del compuesto individual y el diseño experimental. En general, una aplicación de 20-30 segundos de agonista es suficiente para activar G-receptores acoplados a proteínas en las neuronas y células gliales. Sin embargo, los canales iónicos activados por ligando (tales como los receptores nicotínicos de la acetilcolina) requieren tiempos de aplicación de no más de 5-10 segundos. Otras exposiciones duración causarán ligando canales iónicos a Dese rápidamentensitize. Antagonistas deben aplicarse durante aproximadamente 3-15 minutos para asegurar el bloqueo completo de las vías de receptores. Sin embargo, esta es una generalización bruto y los investigadores siempre debe optimizar cualquier fármaco experimental en su paradigma particular. </li><li> Detener la grabación y vista la película de lapso de tiempo del experimento. Seleccionar cuidadosamente las regiones de interés (ROI) utilizando el software de análisis de imagen correspondiente. </li><li> Utilice el software para normalizar y compara ROI intensidad fluorescente en contra de su valor inicial fluorescente línea de base. Los cambios en la fluorescencia normalizada son directamente proporcionales a los cambios en [Ca2 +]. <ol><li> Utilice una modificación de un método descrito anteriormente utilizando 26? F / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) de fondo, donde F1 es la fluorescencia en cualquier dado punto y F0 es la fluorescencia de línea de base, para mejorar la precisión de evaluación. Esto ayuda modificaciónen la reducción de ruido de los cambios de fluorescencia en preparaciones de tejidos que exhiben movimiento de la capa muscular subyacente en el plexo mientérico. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The methodologies described in this manuscript provide a consistent approach to effectively study neurons and enteric glia in the ENS. Although imaging neurons and enteric glia in culture has yielded a wealth of insight into the function of individual cells, studying these cells in their native, multi-cellular environment is crucial for our understanding their physiology and pathophysiology. Fluorescence microscopy is a crucial technique for assessing multidirectional interactions of cells in the ENS. Loading cells of the ENS with selective fluorescent markers and image acquisition with high-resolution microscopy permits quantitative observations of cellular activity in the ENS. Imaging live tissue samples of the ENS is performed relatively quickly and generates large amounts of in-depth functional and spatial data. Mouse myenteric and submucosal plexus preparations used in these experiments allow for molecular and genetic manipulation approaches. Ca2+ imaging in whole-mount preparations provides a useful tool for the assessment of neuron-glia interactions.
In advanced experimental paradigms, several probes can be combined to obtain information about different events within the cells. Fluorescence microscopy can record images with enhanced contrast of specific molecules, if an appropriate fluorescent label is used. Fluo-4 was chosen because it possesses a large dynamic range. Sufficient incubation time is vital when using the AM dyes in ENS. Dye concentration and loading method may need to be adjusted to achieve best results. Ideal preparations should be loaded with sufficient dye to visualize changes in fluorescence but not so much so that the dye chelates the target ions and interferes with intracellular signaling. Exposure to fluorescent light should be limited to prevent phototoxicity in cells and photobleaching of dyes. 
Investigators must be careful with several steps of this experiment, especially solution and tissue preparation. Particular care has to be taken during processing and dissection of ENS tissue in order to maintain cellular functions. The GI tract contains several layers and tissue varieties, which pose challenges for dissection and imaging quality in these whole-mount preparations 27. Furthermore, the interconnecting fiber tracts of the MP are wider and ganglia are larger than those of the SMP 2. The neuronal density of the myenteric plexus is higher compared to that of the submucosal plexus 28. Slow and imprecise dissections will have detrimental effects on the quality of the plexus preparations and thus the overall success of the experiments. Therefore, clean/undamaged tools, practice and manual dexterity are critical to this procedure. 
In whole-mount tissue preparations, careful consideration should be taken when drawing the regions of interest (ROI) to correctly assess the kinetics and degree of observed change in fluorescence intensity of the desired cell type. As the ganglia are located on a contractile muscle layer, motion artifacts caused by gut motility are a primary concern during in situ imaging. Thus, suppressing these motion disturbances through re-pinning tissue preparations after incubation with enzymes and the addition of pharmacological inhibition (nicardipine/scopolamine) to buffers permits clear and reliable image acquisition. Aside from pharmacology and mechanical approaches to prevent tissue movement, recent studies illustrate the application of advanced software methodologies and cell type response characteristics to correct for residual tissue movement in the recordings and improve the accuracy of analysis 29. Barring these technical hurdles, this method provides physiologically relevant conditions to assess morphologic and quantitative characteristics of neurons and enteric glia in the ENS.

El sistema nervioso entérico (SNE) se organiza en dos plexos ganglionares incrustados dentro de la pared del tubo digestivo 1. Estos circuitos neuronales intramusculares, el plexo mientérico (MP) y el plexo submucoso (SMP), se componen de neuronas y glía entérica (Figura 1) 2. El MP y SMP regulan gastrointestinales (GI) funciones tales como la motilidad intestinal y la absorción del epitelio y secreción, respectivamente 3. Glía entérica se encuentran en las proximidades de las neuronas en los ganglios, pero las poblaciones de la glía entérica también existen dentro de la interconexión de los tractos de fibras y porciones extra-ganglionares de la pared intestinal 3,4. Glia entéricas se creía originalmente para proporcionar sólo un apoyo nutritivo para las neuronas. Sin embargo, estudios recientes sugieren fuertemente que las interacciones neurona-glía son esenciales para ENS funciona 5,6. Por ejemplo, los datos muestran que la glía entérica &quot;escuchar&quot; a la actividad neuronal 7y modular los circuitos neuronales 6,8, proteger a las neuronas entéricas del estrés oxidativo 9 y son capaces de generar nuevas neuronas entéricas en respuesta a la lesión 10,11. El protocolo presentado en esta revisión técnica proporciona un método simple y robusto para examinar la compleja interacción entre las neuronas y la glía entérica utilizando in situ intracelular de Ca 2 + de imágenes. Ca 2+ es una molécula de señalización ubicua en las células excitables y juega un papel esencial en los eventos de señalización sináptica en el sistema nervioso 12. La excitación de las neuronas o glía entérica provoca una elevación de la concentración citoplasmática de Ca2 +, ya sea por afluencia a través de canales de Ca2 + permeables o Ca 2 + liberación de las reservas de calcio intracelular. Imagen Ca 2 + transitorios en las neuronas y glía con tintes fluorescentes es un establecidos y técnica ampliamente utilizada para estudiar la organización funcional y dinámica deel 13-17 ENS. Formación de imágenes de Ca 2+ ha demostrado ser una herramienta importante en el estudio de los segmentos de tejido GI intactas para dilucidar la propagación de la excitabilidad a través de redes de marcapasos ICC 18 y músculo liso intestinal 19,20. Se permite a los investigadores para investigar un amplio espectro de parámetros fisiológicos y proporciona información acerca tanto a su distribución espacial y dinámica temporal. Las células se pueden teñir de manera eficiente en una forma mínimamente invasiva mediante el uso de indicadores fluorescentes de membrana permeable y protocolos de tinción optimizados 21. Esto ofrece la oportunidad de controlar un gran número de neuronas y glía entérica en preparaciones funcionalmente conservados 14-16,22, así como in vivo 23. -Todo el montaje preparaciones de tejidos son a granel cargado con una alta afinidad de Ca2 + colorante indicador como Fluo-4 que aumenta su fluorescencia cuando se une a Ca 2+. Los cambios en la fluorescencia se registran por una cámara CCD y analyzed digitalmente 6. El advenimiento de Ca 2+ proporcionó la oportunidad de supervisar las neuronas y células gliales interacciones, la capacidad de respuesta a diversos estímulos, y la participación de estos tipos de células en los procesos gastrointestinales en tiempo real. In situ imagen Ca 2+ ha dado una gran comprensión de los mecanismos de señalización de las neuronas entéricas y glía y posee varias ventajas sobre los modelos de cultivo celular de 6,24. En primer lugar, in situ preparaciones mantener el entorno de la matriz nativa de las neuronas y glia y salen de la mayor parte de sus conexiones con el tejido diana intacta. En segundo lugar, la genética y la morfología de la glía entérica culta significativamente se alteran en comparación con 6,24 en vivo. En tercer lugar, muchas interacciones heterotípicas se pierden en cultivo de células primarias y esto limita la evaluación de las interacciones célula-célula. Aunque las células cultivadas son muy adecuadas para la investigación de las propiedades fundamentales, su usefulness para el estudio de las interacciones complejas entre células gliales y las neuronas entéricas es limitado. La investigación de la interacción neurona-glía utilizando un enfoque in situ es fisiológicamente más relevantes como las vías sinápticas permanecen intactos 25. En comparación con los enfoques de cultivo celular, un enfoque in situ ofrece mejores condiciones para comprender sistemáticamente las intrincadas interacciones entre neuronas y glía entérica. Por otra parte, la organización planar del plexo ganglionares en los preparativos de todo el montaje es ideal para imágenes fluorescentes de intracelular de Ca 2 + transitorios y esta técnica ofrece un enfoque sencillo para evaluar la actividad neuronal glía en la ENS.

<table><tbody><tr><td>BubbleStop Syringe Heater&amp;nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type II, powder</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Roboz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Fixed-stage microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Molecular Probes</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamine</td><td>Sigma</td><td>S1013&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca2+ imaging of the enteric nervous system

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

El uso adecuado de esta técnica permite a los investigadores para medir con precisión Ca2 + intracelular [Ca 2 +] i transitorios en las neuronas entéricas y glía en todo el montaje en preparaciones de tejido. Un ejemplo representativo de un agonista-evocó Ca 2 + respuestas en glía dentro de un ganglio mientérico del colon de ratón se muestra en Video 1. Los resultados siguientes están destinados a ilustrar algunos resultados representativos que hemos obtenido usando este método. En primer lugar, la figura 2 ilustra los resultados de un experimento que mide la glía entérica [Ca 2 +] i los cambios en la respuesta a la estimulación por el ATP dentro de los preparativos de cobaya colon plexo mientérico muscular longitudinal (LMMP). Específicamente, esta figura muestra el método para el análisis adecuado del protocolo experimental enumerados anteriormente, incluyendo el contorno de la ganglionares y asteriscos denotan la localización de las neuronas entéricas mientérico analizado. Estos resultados tambiénllustrate la dosis óptima de un centenar de ATP micromolar en la movilización de [Ca 2 +] i en el conejillo de indias glía mientérico. Esta respuesta puede ser utilizado para calibrar la estimulación glial entérico y normalizar las respuestas para poner a prueba los estímulos. A continuación, la Figura 3 aclara cómo seleccionar adecuadamente las regiones de interés (ROI) que rodea las células gliales, que se muestra y la zona círculos amarillos. Estos resultados también muestran los cambios de fluorescencia deseados bajo condiciones basales y en respuesta a estímulos farmacológicos. Finalmente, la figura 4 muestra las consideraciones espaciales para la elección de la glía entérica y neuronas de [Ca 2 +] i en las respuestas de los preparativos de todo el montaje. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Figura 1. Organización de la ENS. La ENS contiene dos grandes plexos ganglionares. El plexo mientérico se encuentra entre el lcapas musculares ongitudinal y circulares. El plexo submucoso está situado entre la mucosa y la capa muscular circular. La ENS está exclusivamente compuesto por neuronas y glía entérica. Tractos de fibras nerviosas se conectan los ganglios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Figura 2. entérica glía en el conejillo de indias de colon responden plexo mientérico de ATP in situ. (A) Fluo-4 de fluorescencia en un ganglio mientérico (delineado por la línea de puntos) en condiciones basales. Las flechas apuntan a tractos de fibras interganglionic gruesos. (B) Después de la estimulación con 100 mmol / L de ATP, las células gliales, pero no neuronas, aumentan rápidamente Fluo-4 de fluorescencia que indica un aumento de la [Ca 2 +] <sub&gt; i. Tenga en cuenta que las células que responden son pequeñas y rodean las neuronas mucho más grandes (espacios oscuros marcados con un asterisco). (C) glía entérica responder a ATP en una forma dependiente de la dosis con 1 mmol / L provocar respuestas máximas 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> + Células Figura 3. murino S-100-GFP en el colon responden plexo mientérico a ATP in situ. (A) células gliales (verde) en un ratón de colon ganglio mientérico S-100-GFP + (esbozados por línea de trazos). Seis regiones de interés (ROI) que rodea las células gliales en los ganglios se muestran como círculos amarillos. Las flechas indican los tractos de fibras gruesas que llevan en el ganglio. Los asteriscos dubicación enote de 2 neuronas entéricas. (B) La misma muestra de ganglio Rhod-2 fluorescencia bajo condiciones basales. (C) Después de la estimulación con 100 mol / L ATP, las células gliales responden con un aumento de [Ca2 +] i como se muestra por el aumento de Rhod- 2 de fluorescencia. (D) Huellas correspondiente a cada retorno de la inversión se muestra en A-C. (E) con un promedio de respuesta (media ± SEM) de las 6 regiones de interés se muestran en D 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> La Figura 4. En las imágenes in situ de comunicación entérica-neurona-glía a. (A) Imágenes representativas (pseudocoloreada) de un experimento de imágenes de Ca 2+ en su conjunto de montajepreparación del plexo mientérico fue impugnada con el agonista del receptor neuronal P2X7 BzATP (100 m, 30 s). Tenga en cuenta que el agonista neuronal provoca un aumento en la fluorescencia Fluo4 en la neurona (A &#39;) antes de las células circundantes entéricos gliales (A &quot;). (B) Análisis del cambio en la fluorescencia con el tiempo en la glía (azul) y las neuronas (rojo ) tras la aplicación del agonista neuronal, BzATP. (C) Neuronal y respuestas gliales a BzATP en tampón normal (líneas continuas) y en tampón que contenía bajo Ca 2+ y Mg 2+ (líneas de trazos) para potenciar los receptores P2X7 neuronales 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Vídeo 1. agonista-evocó Ca 2 + respuesta en glía entérica ensitu. Este video muestra un ganglio mientérico del colon distal ratón cargado con el Ca 2 + colorante indicador, Fluo-4. El agonista de células gliales, ADP, se añade al baño cuando esté indicado. ADP provoca un aumento de Ca2 + intracelular en glía entérica como se observa por la elevación transitoria de Fluo-4 fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.</a>

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In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervioso entérico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

17.1K vistas.  Michigan State University. The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging. 

Video: In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Investigación

Bioquímica

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neurociencias

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Visualización in vivo del ganglio trigémino de la rata con indicadores de calcio

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their large signal-to-noise ratio makes GECIs a powerful tool for detecting stimulus-evoked activity in sensory neurons. GECIs facilitate population-level analysis of stimulus encoding with the number of neurons that can be studied simultaneously. This population encoding is most appropriately done in vivo. Dorsal root ganglia (DRG), which house the soma of sensory neurons innervating somatic and visceral structures below the neck, are used most extensively for in vivo imaging because these structures are accessed relatively easily. More recently, this technique was used in mice to study sensory neurons in the trigeminal ganglion (TG) that innervate oral and craniofacial structures. There are many reasons to study TG in addition to DRG, including the long list of pain syndromes specific to oral and craniofacial structures that appear to reflect changes in sensory neuron activity, such as trigeminal neuralgia. Mice are used most extensively in the study of DRG and TG neurons because of the availability of genetic tools. However, with differences in size, ease of handling, and potentially important species differences, there are reasons to study rat rather than mouse TG neurons. Thus, we developed an approach for imaging rat TG neurons in vivo. We injected neonatal pups (p2) intraperitoneally with an AAV encoding GCaMP6s, resulting in &gt;90% infection of both TG and DRG neurons. TG was visualized in the adult following craniotomy and decortication, and changes in GCaMP6s fluorescence were monitored in TG neurons following stimulation of mandibular and maxillary regions of the face. We confirmed that increases in fluorescence were stimulus-evoked with peripheral nerve block. While this approach has many potential uses, we are using it to characterize the subpopulation(s) of TG neurons changed following peripheral nerve injury.

Autor destacado: Explorando los mecanismos periféricos del dolor neuropático en la lesión del nervio trigémino 

Genetically encoded calcium indicators (GECI) enable a robust, population-level analysis of sensory neuron signaling. Here, we have developed a novel approach that allows for in vivo GECI visualization of rat trigeminal ganglia neuron activity.

En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their ...

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the protocol for in vivo calcium imaging of the exposed DRG in response to various visceral and somatic stimuli. Pirt-GCaMP6s mice or C57BL6 mice intrathecally injected with AAV viruses packaged with GCaMP6s were utilized to capture Ca2+ transients. The amplitude of these transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. Afferent fibers originate from internal organs, with primary neuronal cell bodies in spinal or vagal ganglia. Studies on visceral nociception and acupuncture analgesia can potentially be conducted on primary sensory neurons using advanced imaging technologies like in vivo calcium imaging, allowing for the recording of neuronal activity ensembles in the intact animal during stimulation or intervention. The responses of DRG neuron ensembles to somatic and visceral stimuli applied to their corresponding receptive fields were recorded. This technique illustrates how neuronal populations react to various types of somatic and visceral stimuli. It is possible to comprehensively compare neuronal ensemble responses to different stimuli, which is a particularly valuable approach in research on visceral pain and segmental mechanisms of somatic stimulation, such as acupuncture.

The present protocol outlines in vivo calcium imaging for measuring the responses of ensembles of lumbar-6 DRG neurons to somatic and visceral stimuli. Thorough comparisons can be made among neurons responding to different stimuli. This protocol is valuable for investigating mechanisms of visceral pain and somatic stimulation, such as acupuncture.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

In Situ Ca ²⁺ Imaging del sistema nervioso entérico

Resumen

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Capítulos en este video

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli