Todos los autores contribuyeron a la creación y validación de la prueba presentada y el proyecto del manuscrito.

Todos los procedimientos experimentales con animales en el protocolo siguen las pautas de cuidado de animales de Technische Universität München, Alemania. 1. Medios / Extracto de Preparación <ol><li> Homogeneización de tejidos La calidad de la homogeneización del tejido es fundamental para la posterior detección de alteraciones de plasticidad en las neuronas cultivadas. Aquí, se recomienda un homogeneizador que permite la disociación de tejido sin gran aumento en la temperatura del tejido. <ol><li> Transferencia de 5 mm x 5 mm x 5 mm cubos de tejido pancreático directamente desde -80 º C en nitrógeno líquido y coloque en una fase sólida en el homogeneizador de tejidos. El homogeneizador ideal sería disociar el tejido lo suficientemente rápido, sin que llegue a descongelar la imagen. </li><li> Inmediatamente después de la disociación, resuspender el, homogeneizado de tipo polvo sólido en 300-500 l de 0,1 x de buffer fosfato salino (PBS). En este caso, no utilice ningún buffer de lisis (como RIPA), ya que esto puede lisar las neuronas.</li><li> Se centrifuga el homogeneizado durante al menos 15 minutos a la velocidad máxima de su centrífuga de mesa (por ejemplo, 21.130 xg). Recoger el sobrenadante claro que representa el extracto de tejido. </li></ol></li><li> Sobrenadantes línea celular <ol><li> Deje que las células de interés alcancen al menos el 70 - 80% de confluencia en medio de crecimiento normal. </li><li> Por lo general, estos medios contienen los componentes del suero y pueden ejercer efectos incontrolables sobre el crecimiento neuronal. Por lo tanto, después de alcanzar la densidad celular deseada, lávese las células por lo menos 3 veces con PBS grado de cultivo de células y colocarlas en un medio libre de suero (SFM) para un máximo de 48 horas. Nota: Aquí, consideran que algunas células (como las células estrelladas pancreáticas) pueden necesitar suero en su medio de crecimiento con el fin de mantener su estado y estructura normal. En tales casos, realizar diluciones seriadas de suero en el medio de la célula de interés con el fin de encontrar el contenido más bajo posible de suero necesaria para funcio célula intactan. </li><li> Medir la concentración de proteína del homogeneizado de tejido o sobrenadantes de células a través de ensayo de proteínas de Bradford. Mientras que estos valores varían dependiendo del tejido y tipo celular, para los extractos de tejido pancreático, uno podría esperar un intervalo de concentración entre 5-12 g / l, y para sobrenadantes de líneas celulares entre 3-8 g / l. </li></ol></li></ol> 2. Extractos alícuotas y sobrenadantes celulares Dependiendo de la concentración para ser utilizado en el ensayo, la concentración final del extracto sobrenadante o en el medio neuronal debe ser de 100 mg / ml de 5,8. Nota: Para un ensayo con las neuronas crecen en 500 l de medio en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, se necesita 50 g de proteína de cada extracto o sobrenadante por pocillo. A una concentración de extracto típico de alrededor de 10 g / l, se necesitaría 5 l de extracto / sobrenadante de cada pocillo. En cada setting realizado como triplicado, esto correspondería a 15 l de extracto / sobrenadante. Para tejidos o de células diferentes tipos, realizar diluciones en serie del extracto final o la concentración de sobrenadante y comparar los efectos neurotróficos observadas entre las diferentes concentraciones de extracto / sobrenadante. 3. Aislamiento de Neuronas Una vez que la recolección de extraer / sobrenadante está terminado, continuar con el aislamiento de las neuronas. <ol><li> Para las neuronas DRG, recoger el cuello uterino para lumbar DRG de ratas recién nacidas entre el día postnatal (P) 2-12 después de la decapitación y disección estereomicroscópica de DRG (Figura 1A). Con el fin de tener las neuronas DRG suficientes para una placa de 24 pocillos, recoja toda la cervical a lumbar DRG de una rata recién nacido (que equivale a 52 DRG) por plato. <ol><li> Recorte el periférico (nervios) y las proyecciones centrales (raíces) de DRG a través de micro tijeras. Dejando las proyecciones en el lugar impide la trituración y aumenta tque la contaminación del riesgo de la cultura por los fibroblastos. </li></ol></li><li> Para neuronas MP, cortar el mesenterio del intestino delgado y manualmente y tira con cuidado la capa de seromuscular del intestino delgado (para un protocolo detallado en el aislamiento MP, consulte Schäfer et al. 9, Figura 1B). Para MP, recoger el plexo de dos ratas por 24 pozos de la placa. Nota: Trate de ser lo más suave posible para evitar roturas en la capa seromuscular ya que impiden el éxito de su separación del intestino delgado. </li><li> Recoger el DRG y la capa seromuscular en medio esencial mínimo enfriado con hielo (MEM) suministrado con gentamicina (20 mg en un medio de 500 ml) y metronidazol (2,5 mg en 500 ml de medio). </li><li> Tras la recogida de DRG, los incuban en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) suministrado con colagenasa de tipo II durante 20-30 min. Para el aislamiento MP, incubar en colagenasa tipo entre 1-3 horas, dependiendo de la edaddel animal (Figura 1C). </li><li> Para MP, recoger las reticulares MP pedazos bajo microscopio estereoscópico y traslado al MEM helada. </li><li> Luego se tritura el DRG y MP a través de jeringas con diámetro decreciente. Nota: trituración excesiva puede destruir las neuronas, pero menos que las células de la glia. </li><li> Una vez que el medio que contiene el DRG o MP se ha convertido en nublado, centrifugar la suspensión a 93,9 xg durante 5 min, se elimina el medio y volver a suspender en medio Neurobasal (suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,5 mM de L-glutamina y 2% B-27). </li><li> Contar el número total de células (es decir, neuronas y células gliales) por medio de un hemocitómetro. Nota: El número de células necesarias depende del parámetro de medición. Para la cuantificación de la densidad de neuritas, uno necesita las culturas más densas y por lo tanto un mayor número de células que para la medición del crecimiento de neuritas, el tamaño perikaryonaly el patrón de ramificación de las neuronas individuales. Para mediciones de la densidad de neuritas, utilizar por ejemplo 10.000 células (neuronas glia +) / pocillo o 1500 neuronas / pocillo. Para la morfometría de las neuronas individuales, breve (1 minutos de duración) tripsinación de las células y la siembra de 2.500 células / pocillo o 400 neuronas / así se recomienda. El rendimiento típico de células obtenidas de una rata es de alrededor de 300.000-500.000 células. </li><li> Seed las células en cubreobjetos de 13 mm que se han recubierto la noche anterior y arriba los pocillos con medio Neurobasal (suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0.5 mM de L-glutamina y 2% de B-27) (figura 1D). Nota: El uso de poli-D-lisina (40 mg / m 2) O-ornitina y laminina cubreobjetos recubiertos (1 mg / ml cada una) recubiertas. Las células se adhieren a poli-D-lisina extremadamente rápido, por lo que es adecuado para experimentos en los que se necesitan muchas células (es decir, medidas de densidad de neuritas). El apego a la laminina es de alguna generaleslo más débil, pero la laminina es un fuerte promotor del crecimiento de neuritas. Por lo tanto, para mediciones en la ramificación neuronal y la longitud de las neuritas, prefieren ornitina / laminina-recubrimiento. </li><li> Permitir que las células se adhieren a los pozos durante la noche. Al día siguiente, la preparación de los medios de comunicación de extracto suplementado (a una concentración de extracto / sobrenadante final de 100 g / ml). </li><li> Aspirar el medio de siembra, y realizar una, de lavado muy suave opcional con PBS, y luego lentamente pipetear los medios de comunicación extracto / sobrenadante suplementado (Figura 1E). </li><li> Deje que las células crezcan durante 48 horas. Aspirar los medios de comunicación y fijar en el 4% paraformaldehido durante inmunotinción (Figura 1F). </li><li> Realice doble tinción de inmunofluorescencia usando específica de neuronas (por ejemplo, beta-tubulina III) y específica glia (por ejemplo glial fibriallary proteína ácida / GFAP) marcadores (Figura 1G). </li><li> Para la morfometría, use un microscopio de luz invertido equipado con una cámara CCD en combinación with software automatizado que permite la medición de la densidad de axones (véase el cuadro). </li><li> La densidad de axones de cultivos neuronales se mide en 4-5 microfotografías representativas a 200 aumentos de 4 regiones diferentes de crecimiento más denso en cada cubreobjetos mediante la superposición de un 50 micras x 50 micras rejilla y contar la densidad de las fibras por metro cuadrado medido en las fibras de intersección. El crecimiento de neuritas, número de ramas por neurona significa, la longitud de la rama media y tamaño perikaryonal se pueden medir de seleccionados al azar 30 neuronas solitarios de cada cubreobjetos mediante el marcado de las neuritas y perikarya (Figura 1H). </li></ol>

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen intereses en conflicto y no divulgación de información financiera.

El presente protocolo tiene por objeto ilustrar la metodología detrás del ensayo de la neuroplasticidad pancreática in vitro que fue desarrollado recientemente por nuestro grupo para estudiar los mecanismos de neuroplasticidad en el CP y CP 5. El protocolo consiste en un procedimiento de tres días que se pueden aplicar fácilmente una vez que el artista intérprete o ejecutante ha adquirido suficiente experiencia en el aislamiento y cultivo de neuronas de DRG y MP. Además, representa una herrami...

Las alteraciones en la gastrointestinal (GI) morfología del nervio y la densidad han llamado la atención de los gastroenterólogos y patólogos durante mucho tiempo, pero su relevancia para la fisiopatología de las enfermedades gastrointestinales se desconoce 1-3. De hecho, varios trastornos GI altamente comunes tales como la gastritis, la esofagitis de reflujo, la colitis, diverticulitis y apendicitis se asocian con el aumento de la densidad de inervación en áreas tejido inflamado 1. Sin embargo, hasta ahora no se ha prestado atención real a los mecanismos y significado de la neuroplasticidad en el tracto GI. ¿Los nervios GI morfológicamente alterados difieren de los nervios normales GI, es decir, el estado normal del sistema nervioso entérico, en términos de su función? ¿Cuáles son las implicaciones de la alteración del contenido de neuropéptido / neurotransmisor en los nervios entéricos de plástico? ¿Tiene la neuroplasticidad periférica siempre implica la señalización alterada para el sistema nervioso central? ¿Y dónde están las proyecciones centrales de extri plásticovías neurales GI NSIC? Una larga serie de tales preguntas clave se puede generar fácilmente cuando se mira a la escasez de nuestros conocimientos sobre los aspectos funcionales de la neuroplasticidad GI. El estudio de la neuroplasticidad GI a nivel funcional requiere modelos experimentales válidos, reproducibles y todavía fácilmente aplicables. En una era de creciente popularidad y la aceptación de modelos de ingeniería genética condicionales de ratón (GECoMM), como en entornos in vivo tienen el potencial para dilucidar aspectos hasta ahora desconocidos de la neuroplasticidad GI de una manera realista 1. Sin embargo, el diseño y la producción de GECoMM sigue siendo costoso, laborioso y, sobre todo, requiere mucho tiempo. Además, requieren la selección a priori del objetivo a ser modulada condicionalmente en el ratón alterado genéticamente (por ejemplo, la sobreexpresión transgénica de factor de crecimiento nervioso / NGF en células epiteliales intestinales). Por lo tanto, para la design de un GECoMM éxito, los investigadores necesitan algunos indicadores (por ejemplo, datos experimentales anteriores) de un objetivo que vale la pena, es decir, que la molécula de interés (en este caso NGF) por lo menos se puede esperar para ejercer algunos efectos biológicamente relevantes sobre los nervios de GI. Tales indicadores se puede derivar fácilmente de ser adecuada en modelos in vitro en la que los subtipos de células aisladas del complejo microambiente de un sistema in vivo se pueden cocultured selectivamente de una manera heterotípicos 4-7. La modulación de dianas moleculares en un ambiente de cultura tan heterotípica es, en promedio, técnicamente menos complicado, más rápido, y por lo tanto puede ayudar en el filtrado previo de las metas que valgan la pena para la verificación de los estudios in vivo. Recientemente, presentamos un ensayo in vitro neuroplasticidad en el cual fue diseñado para simular el aumento de la densidad neuronal y la hipertrofia de ne intrapancreáticarves en el cáncer de páncreas humano (PCA) y pancreatitis crónica (PC) tejidos. Aquí, las neuronas derivadas de recién nacido dorsal de rata ganglios de la raíz (DRG) o plexo mientérico (MP) se expusieron a extractos de tejido de CaP resecado quirúrgicamente o CP tejidos muestras y se compararon con las cultivadas en el páncreas humano normal (NP) extractos de tejido 5. En lugar de extractos de tejidos, también se puede utilizar sobrenadantes de líneas celulares para estudiar el impacto de los tipos de células seleccionadas en la neuroplasticidad. Cuando se combina con una medición morfométrica estándar, el ensayo de la neuroplasticidad presentado permite la evaluación válida y reproducible de la plasticidad neuronal en respuesta a diferentes microambientes pancreáticas. Particularmente, se permite la simulación de 1) la neuroplasticidad morfológico, es decir, los cambios en el crecimiento de neuritas, el patrón de ramificación y tamaño neuronal, y 2) la neuroplasticidad funcional, es decir, alteraciones en la excitabilidad de las neuronas periféricas. Por otra parte, no sólo periférica (es decir </em&gt; Entérica), sino también central (por ejemplo DRG o segundo médula orden) las neuronas se pueden incluir en el presente ensayo para evaluar su reacción morfológica y funcional a diferentes contenidos de tejido GI. En el presente video tutorial, se demuestra el protocolo técnico para la realización de este ensayo y se discuten sus ventajas y debilidades. Por otra parte, llamamos la atención sobre la aplicabilidad de la noción básica de este ensayo para el estudio de la neuroplasticidad en cualquier órgano GI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

La neuroplasticidad es una característica inherente del sistema y gastrointestinal (GI) inervación nervioso entérico en condiciones patológicas. Sin embargo, el papel fisiopatológico de la neuroplasticidad en trastornos GI sigue siendo desconocido. Modelos experimentales novedosas que permiten la simulación y la modulación de la neuroplasticidad GI pueden permitir una mayor apreciación de la contribución de la neuroplasticidad en particular las enfermedades gastrointestinales, como el cáncer de páncreas (CP) y la pancreatitis crónica (PC). Aquí, se presenta un protocolo para la simulación de la neuroplasticidad de páncreas en condiciones in vitro utilizando recién nacido ganglios dorsales de rata raíz (DRG) y el plexo mientérico (MP) neuronas. Este enfoque de doble neurona no sólo permite la monitorización de tanto la neuroplasticidad-órgano intrínseca y extrínseca-, pero también representa una herramienta valiosa para evaluar la morfología neuronal y glial y electrofisiología. Además, permite la modulación funcional de contenidos microambientales suministrados por el estudio de su impact en la neuroplasticidad. Una vez establecido, el presente ensayo neuroplasticidad tiene el potencial de ser aplicable al estudio de la neuroplasticidad en cualquier órgano GI.

Neuroplasticidad morfológica En el rango de edad indicado de ratas recién nacidas (P2-12) y las densidades de siembra, MP y DRG neuronas ya construir densas redes neuronales después de 48 horas (Figura 2A). Comparación de la densidad de axones entre las neuronas cultivadas en el CP, CP y sus extractos NP revela una mayor densidad de axones de las neuronas DRG en el CP o extractos del PP que en los extractos NP (Figura 2A) 5. Particula...

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Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Plasticidad neuronal es una característica de la (GI) tracto gastrointestinal cada vez más reconocido, pero insuficientemente entendida. Aquí, en el ejemplo de trastornos pancreáticos humanos, se presenta un ensayo de neuroplasticidad in vitro para el estudio de la plasticidad neuronal en el tracto GI, tanto a nivel morfológico y funcional.

Simulación de páncreas Neuroplasticidad:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neurona Plasticidad Ensayo

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

9.7K vistas.  Technische Universität München.  Plasticidad neuronal es una característica de la (GI) tracto gastrointestinal cada vez más reconocido, pero insuficientemente entendida. Aquí, en el ejemplo de trastornos pancreáticos humanos, se presenta un ensayo de neuroplasticidad in vitro para el estudio de la plasticidad neuronal en el tracto GI, tanto a nivel morfológico y funcional. 

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In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

Ensayo in vitro Liquidación mesoteliales que modela los pasos iniciales de la metástasis del cáncer ovárico

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Investigación

Medicina

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio based cues and set within the context of a video game metaphor, users gather relevant spatial information regarding a building's layout. This allows the user to develop an accurate spatial cognitive map of a large-scale three-dimensional space that can be manipulated for the purposes of a real indoor navigation task. After game play, participants are then assessed on their ability to navigate within the target physical building represented in the game. Preliminary results suggest that early blind users were able to acquire relevant information regarding the spatial layout of a previously unfamiliar building as indexed by their performance on a series of navigation tasks. These tasks included path finding through the virtual and physical building, as well as a series of drop off tasks. We find that the immersive and highly interactive nature of the AbES software appears to greatly engage the blind user to actively explore the virtual environment. Applications of this approach may extend to larger populations of visually impaired individuals.

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind.

Desarrollo de un entorno de juego basado en audio virtual para ayudar con habilidades de navegación en la ciega

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

Un modelo murino de la médula espinal cervical Lesión en estudio post-lesional Respiratorio Neuroplasticidad

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Análisis de Conversión de proteínas

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

Un alto contenido<em&gt; In Vitro</em&gt; Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of pancreatic body. With technological development, the robotic surgical system has shown its advantage in minimally invasive surgery and been increasingly applied in central pancreatectomy. However, reconstruction of the continuity of pancreas with end-to-end anastomosis after robotic central pancreatectomy has not been applied. In this study, we report surgical techniques for robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis. The pancreas is reconstructed by duct-to-duct anastomosis of the pancreatic duct with a pancreatic stent inserted in the two stumps of pancreatic duct, and by end-to-end anastomosis of the pancreatic parenchyma. Compared with traditional central pancreatectomy with pancreaticoenteric anastomosis, this approach decreases the operative injury to the patient, and also conserves the integrity and continuity of the digestive duct and pancreatic duct. The robotic surgical system integrated with multiple instruments with flexible and precise movement is particularly suitable for the dissection and reconstruction of the pancreatic duct. We found that robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is safe and feasible, and we need more experience to evaluate its best indications and long-term outcomes.

The robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is feasible and safe for tumor in the pancreatic neck and proximal portion of pancreatic body. The operative techniques of this operation are presented.

Aplicación de End-to-end Anastomosis en robótica Pancreatectomía Central

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal trasplante de islotes pancreáticos en modelo murino

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Visualización de complejos endógenos de mitophagy in Situ en células beta pancreáticas humanas que utilizan el ensayo de ligadura de proximidad

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...