Para empezar, recubre los insertos Transwell con 42 microlitros de 0,05%Matrigel. Incubar durante una hora a 37 grados centígrados para permitir que Matrigel cuaje. Aspire el medio extra y seque los Transwells durante 30 minutos sin tapar.
A continuación, añada 200 microlitros de medio DMEM F12 a cada inserto y guárdelo a 37 grados centígrados hasta su uso. Lave las hamburguesas Matrigel que contienen los organoides con PBS. Exponerlos a 500 microlitros de recuperación de células mientras están en hielo, y pipetear la mezcla repetidamente para asegurar una colección completa de células en un tubo de 15 mililitros.
A continuación, centrifugar el tubo a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender la célula en el volumen objetivo de célula madre epitelial intestinal o medio IESC. Ahora, recubra previamente una jeringa de un mililitro en medio IESC, aspire la suspensión celular a través de una aguja de calibre 16.
A continuación, sustituya la aguja de calibre 16 por una aguja de calibre 28 y expulse la suspensión para favorecer la separación de los organoides. A continuación, coloque 200 microlitros de la suspensión celular resultante en el lado apical de los Transwell recubiertos. Agregue 500 microlitros de medio IESC y factores de crecimiento en el lado basal.
Utilice una cámara de medición de TEER de doble electrodo para cuantificar el TEER en las monocapas. Llene el recipiente de cultivo con 1,5 mililitros de medio IESC y asegúrese de que haya exactamente 200 microlitros de medio en el inserto Transwell, de modo que los niveles de líquido coincidan durante la medición. Exponga la cara basolateral de los insertos Transwell a citocinas inflamatorias de interleucina-1 beta o productos gliales de cultivos expuestos a interleucina-1 beta.
Mida el TEER cada 10 a 15 minutos durante 45 minutos colocando cada Transwell en la taza de cultivo. La exposición basolateral a medios de cultivos gliales tratados con 10 y 25 nanogramos de interleucina-1 beta aumentó significativamente la permeabilidad de la barrera epitelial. No se observó un aumento significativo en la permeabilidad epitelial después de la exposición a la interleucina-6 equina en varias concentraciones.
