Agradecemos al Dr. Harvey Hensley por su soporte técnico especializado. Este trabajo se benefició de la utilización de los siguientes Fox Chase Cancer Center (FCCC) Instalaciones: Laboratorio de Servicio de Animales y el Fondo de Pequeños Animales de imágenes. Este trabajo fue apoyado en parte por el SPORE cáncer de ovario en el FCCC / Universidad de Pensilvania (P50 CA083638), la Convención Marco núcleo de subvención (P30 CA006927), y el Fondo de Investigación del Cáncer de ovario.

I. Preparación de las células tumorales de ovario <ol><li> Crecer líneas celulares de cáncer de ovario que expresan luciferasa en la cultura. Fuentes de la luciferasa se puede Firefly, Renilla, o de otras especies. Las células que expresan proteínas fluorescentes también se puede utilizar. Para esta demostración se utiliza un cáncer de ovario línea celular, OVCAR5, expresando luciferasa de luciérnaga. </li><li> Las células de la cosecha utilizando la técnica de rutina de cultivo celular. </li><li> Mantener la suspensión de células (10.000 células / l) en tampón fosfato salino (PBS) en hielo hasta el momento de la inyección. </li></ol> II. Inyección intrabursal Este procedimiento requiere la ayuda de una segunda persona. Todos los procedimientos quirúrgicos se llevan a cabo en condiciones asépticas. Esto incluye el uso de vestimenta quirúrgica y el uso de instrumentos quirúrgicos estériles, jeringas y agujas. <ol><li> Prepare la solución anestésica mediante la mezcla de 3 ml de clorhidrato de ketamina (100 mg / ml), 1,6 ml de clorhidrato de xilazina (100 mg / ml), 1,5 ml de acepromacina (10 mg / ml) y 20 ml de cloruro sódico al 0,9%. </li><li> Compruebe el número de identificación del animal y la salud observable. Anestesiar al animal preparado ketamina-xilazina-acepromacina a través de la anestesia por vía intraperitoneal (ip) con un volumen de dosis de 8 ~ 9 ml / kg de peso corporal (PC). </li><li> Confirmar que el animal está bajo un claro aceptable de la anestesia mediante la realización de un sujetador con codo con pinzas o los dedos de las patas traseras del animal. Si no es reflejo de pedal, espere un profundo plano de la anestesia hasta que el animal no responde a este procedimiento. </li><li> Coloque la cara dorsal de los animales sobre una gasa estéril con la cabeza de espaldas y la cola hacia usted. El punto de incisión se encuentra a la izquierda oa la derecha de la línea media y por encima de los ovarios. Afeitarse o mojar la piel con alcohol al 70% en el punto de incisión. </li><li> Levante la piel humedecida con unas pinzas y hacer una pequeña incisión con la tijera en la posición dorsomedial y justo encima de la almohadilla de grasa de ovario. La almohadilla de grasa de ovario deben ser visibles por debajo de la superficie de la pared peritoneal. Almohadilla de grasa es fácilmente reconocible por su color blanco, en contraste con el tejido de color rosado oscuro que lo rodea. </li><li> Levante suavemente el revestimiento de la pared peritoneal y hacer una pequeña incisión como se describió anteriormente (5). </li><li> Coloque una almohadilla estéril gasa empapada en solución salina en la línea media al lado de la incisión. Ubique la almohadilla de grasa de ovario y tire de él y el resto que en la gasa. Estabilizar el ovario por la unión de la almohadilla de grasa con un clip de bulldog. Bajo un microscopio de disección, la posición del ovario como para permitir la inserción de la aguja (calibre 30, G) en la curva túbulo oviducto conduce a la bolsa. Cuando la aguja se inserta en la posición correcta, debe ser visible en la bolsa. </li><li> Empuje suavemente el émbolo de la jeringa para inyectar 5 l de la suspensión celular entre la bolsa y el ovario, mientras que la jeringa se coloca al sitio de la inyección. Este paso requiere de dos personas. Una persona empuja el pistón, mientras que la otra persona mantiene la posición de la aguja. Retire la aguja rápidamente para sellar el sitio de la punción, pero con cuidado suficiente para no romper la bolsa y los túbulos. La bolsa debe aparecer ligeramente distendido con una correcta inyección. </li><li> Comunicado de la almohadilla de grasa de la pinza bulldog y suavemente reemplazar el aparato reproductor y la espalda almohadilla de grasa en la cavidad peritoneal. Cierre suavemente la pared del cuerpo tirando de la membrana peritoneal superior sobre el revestimiento inferior. Cerca de la piel con grapas quirúrgicas o grapas de heridas. </li><li> Colocar el animal recupera de nuevo en su jaula y proporcionar una fuente de calor segura para evitar la hipotermia y acelerar la recuperación. Monitor de la frecuencia respiratoria y la facilidad, el retorno del tono muscular y la capacidad de mover voluntariamente. Estos son buenos indicadores de la progresión hacia la recuperación. Grapas o clips de heridas pueden ser removidos de 7 o más días después de la cirugía. </li></ol> III. La administración oral masiva <ol><li> Use una aguja de 18 ~ 20 G sonda o tubo de alimentación con una punta redondeada. La aguja de sonda no debe ser mayor que la distancia desde la punta de la cabeza del animal a su última costilla. </li><li> Compruebe el número de los animales, la identificación y la salud observable. Suavemente pescuezo del animal sujetando la piel sobre los hombros con el pulgar y los dedos. La restricción debe ser sólo lo suficientemente firme como para los miembros anteriores que se extiende a cada lado y fuera del camino. El animal no debe ser capaz de comprender a la aguja. </li><li> Tire suavemente la cabeza del animal con su dedo índice, formando una línea recta a través del cuello y el esófago. Apoyo para la espalda del animal con la parte interior del dedo pulgar. </li><li> Con suavidad y sin forzar, insertar la aguja sonda a ambos lados de la boca y la lengua. En un movimiento suave, la aguja debe pasar con el techo de la boca y el esófago. La gravedad debe guiar la aguja hacia abajo, sin encontrar resistencia. Si hay alguna resisce, retire la aguja y empiece de nuevo. Gag del animal y el reflejo de tragar puede ser activado durante la inserción. Sin embargo, no debe haber resistencia o jadeo del animal. Es importante asegurarse de que el animal vuelve a respirar cuando la aguja está en su lugar marcando el movimiento de la nariz y el pecho. </li><li> Empuje lentamente el émbolo de la jeringa para dispensar el volumen de la dosis. </li><li> Retire con cuidado la aguja por sonda nasogástrica en el mismo ángulo y la vía como la forma en que se inserta en el esófago. </li><li> Devolver el animal a la jaula y la respiración del monitor y el comportamiento de 5 a 10 minutos. </li></ol> IV. Imágenes in vivo Usamos las Ciencias de la pinza de vida para controlar el comportamiento de las células inyectadas en la cavidad de la bursa. Los experimentos con este sistema suelen tener un plazo de 4 a 16 semanas desde el momento de la implantación del tumor. <ol><li> Prepare la solución de D-luciferina (sustrato de la luciferasa de luciérnaga) disolviendo 5 ~ 20 mg en 1 ml de PBS y filtrado a través de la membrana 0,22 micras para la esterilización. </li><li> Cargue la cámara de inducción mediante la activación de ambos el oxígeno y el gas isoflurano. Encienda el flujo de gas a la cámara de inducción solamente. La tasa de flujo de isoflurano se mantiene en un nivel bajo hasta que los animales están listos para ser fotografiado. </li><li> Compruebe el número de los animales, la identificación y la salud observable. Colocar el animal en la cámara de inducción cargado con gas isoflurano. </li><li> Quitar el animal de la cámara cuando el animal parece estar anestesiado. Entregar 200 l de solución de luciferina preparado a través de la inyección ip con 30 agujas G. Es importante registrar el momento de la inyección con el fin de mantener el tiempo constante entre la inyección de luciferina y un rendimiento de imagen en todo el estudio. </li><li> Coloque la parte posterior de los animales luciferina-se inyecta en la cámara de inducción. </li><li> Establecer el sistema de imágenes para la configuración adecuada. Asegúrese de inicializar el sistema antes de la adquisición de la imagen de los animales en primer lugar. </li><li> Cierre el flujo de gas a la cámara de inducción y encienda el flujo de gas a la cámara de imágenes. </li><li> Coloque el dorsal de los animales anestesiados o con la parte ventral hacia arriba. Asegúrese de colocar la nariz de los animales en un cono de la nariz para mantener la inducción de la anestesia adecuada. Asegúrese de que el animal está en el &quot;punto de la red de intereses&quot;, según lo indicado por la iluminación de color verde. </li><li> Cierre la puerta de la cámara y obtener la imagen en el momento adecuado. El tiempo puede ser determinada por la cinética. </li><li> Quitar el animal de la cámara de imagen y colocarla de nuevo en su jaula. Monitorear la recuperación de los animales como se describe en &quot;inyección bursa&quot;. </li></ol> V. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Imágenes in vivo de células de tumor de ovario en un modelo murino ortotópico. OVCAR5 células que expresan luciferasa fueron inyectados intrabursally en el ovario derecho y la imagen en el tiempo. Las imágenes fueron tomadas 13 (izquierda), 17 (centro) y 22 (derecho) días después de la inyección, utilizando el espectro de IVIS sistema de imágenes. Lado dorsal se muestra en el panel superior y la parte ventral es en el panel inferior. Tenga en cuenta que la propagación de las células tumorales peritoneales 22 días después de la inyección. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por animal de Atención Institucional Fox Chase Cancer Center y el empleo.

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El cáncer de ovario es la principal causa de muerte entre las malignidades ginecológicas 1. La alta tasa de mortalidad de esta enfermedad es en gran parte debido a su diagnóstico tardío y la falta de métodos fiables de diagnóstico 2. Además, la quimioterapia convencional a menudo se encuentra con quimiorresistencia y la recidiva del cáncer 3. Por lo tanto, nuevas terapias se requiere para hacer frente eficazmente esta enfermedad. En el desarrollo de nuevas terapias dirigidas a cáncer de ovario humano, es fundamental para desarrollar un modelo animal representativo. Un modelo animal ortotópico tiene ventajas sobre los modelos de xenoinjerto convencionales (por ejemplo, inyecciones subcutáneas o intraperitoneal de células tumorales) en que: 1) que reproduce el sitio primario de la formación de tumores, 2) que representa el sitio común de metástasis, y 3) que proporciona a las células tumorales interactuar con microambiente apropiado 4, 5, 6, 7, 8. Los roedores tienen una membrana única la bolsa que rodea el ovario y se continua con el oviducto. Este singular anatomía de los roedores permite la inyección de células tumorales de ovario ortotópicamente. Intrabursally inyectaron células de tumor de ovario se comportan similar a la enfermedad humana, con lo cual cada vez mayor dentro de la membrana y la difusión de la bursa en la cavidad peritoneal del tumor a medida que avanza. La inyección de células que expresan establemente luciferasas o proteínas fluorescentes permite también el seguimiento de la conducta de las células tumorales en tiempo real. Bioluminiscentes y / o la tecnología de imágenes fluorescentes permite repetidamente las celdas de imagen del tumor durante un período prolongado de tiempo y el crecimiento del tumor estudio, la distribución, y la regresión en forma no invasiva 9, 10, 11. Al establecer el modelo ortotópico, es fundamental para eliminar rápidamente la aguja de la bolsa tras la inyección. Retirada brusca de los sellos de la aguja de punción y evita la fuga de las células inyectadas. Sin embargo, al mismo tiempo, el movimiento debe ser suave para no romper la bolsa. En caso de fuga durante la inyección, puede causar que las células de las semillas en el abdomen y potencialmente confundir el estudio, es decir, la eyaculación difusión fuera del ovario. En este caso, el animal específico debe ser registrada y seguido para el desarrollo de sitios múltiples tumores en el peritoneo, antes del tratamiento o, alternativamente, eliminados de los análisis posteriores. Antes de realizar una sonda nasogástrica, es fundamental para comprobar la longitud de la sonda de alimentación, midiendo desde la punta de la cabeza del animal a la última costilla. Es útil para marcar el tubo en la nariz del animal y no pasar el tubo más allá de esta marca. La inserción del tubo más allá de esta marca puede dar lugar a una perforación en el estómago. La determinación de la longitud del tubo es especialmente importante en los animales jóvenes o animales que pesen menos de 20 g. Tras la inserción de la aguja de una sonda por el esófago, no debe haber resistencia o lucha de los animales. Es importante no administrar la solución o suspensión demasiado rápido ya que esto puede conducir a reflujo y posteriormente entregar volumen de la dosis incorrecta, así como la adición de estrés para el animal. Para obtener unos resultados de imagen comparable de vez en cuando, es conveniente mantener el tiempo entre la inyección constante de sustrato de luciferasa y de imagen. El lapso de tiempo se puede determinar mediante la adopción de una serie de imágenes después de la inyección del sustrato y observar la cinética de las señales. Desarrollo de un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario, la administración oral de fármacos, y en vivo de imágenes son las técnicas necesarias para una mejor comprensión del desarrollo y propagación del cáncer de ovario y la evaluación de nuevos regímenes terapéuticos que en última instancia, puede mejorar los resultados de los pacientes con esta enfermedad mortal.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

El cáncer humano y respuesta al tratamiento es mejor representados en los modelos animales ortotópico. Este trabajo describe el desarrollo de un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario, el tratamiento del cáncer a través de la administración oral de fármacos, y el seguimiento del comportamiento de las células tumorales en la respuesta al tratamiento farmacológico en tiempo real utilizando en el sistema de imágenes in vivo. En este modelo ortotópico, las células ováricas tumorales que expresan luciferasa se aplican por vía tópica mediante la inyección directamente en la bolsa del ratón, donde se encierra cada ovario. Tras la inyección de D-luciferina, un sustrato de luciferasa de luciérnaga, la luciferasa de células que expresan generar señales de bioluminiscencia. Esta señal es detectada por el sistema de imágenes en vivo y permite un medio no invasivo de la vigilancia del crecimiento del tumor, la distribución, y la regresión en los animales. La administración de fármacos a través de una sonda nasogástrica permite un volumen máximo de dosificación de 10 ml / kg de peso corporal que se entregarán directamente en el estómago y se asemeja mucho a la entrega de medicamentos en tratamientos clínicos. Por lo tanto, las técnicas aquí descritas, el desarrollo de un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario, la administración oral de fármacos, y de imágenes in vivo, son útiles para una mejor comprensión del cáncer de ovario humano y el tratamiento y mejorar la orientación de esta enfermedad.

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Ortotópico modelos animales de cáncer de ovario reproducir mejor las enfermedades humanas y por lo tanto, mejorar nuestra comprensión de la progresión del cáncer y la respuesta del tumor a la terapia. Un modelo de ratón recibe una inyección intrabursal de luciferasa que expresan las células tumorales de ovario. El tratamiento se administra a través de una sonda nasogástrica. El crecimiento del tumor está controlado por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema de imágenes.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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Video: In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

Investigación

Biología

Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and future drug-eluting stents.
A variety of antibodies and transgenic and knockout strains are available in rats. Consequently, a model for in-stent restenosis in the rat would be convenient for pathobiological and pathophysiological studies. 
In this video, we present the full procedure and pit-falls of a rat stent model suitable for high throughput stent research. We will show the surgical procedure of stent deployment, and the assessment of in-stent restenosis using the most elegant technique of OCT (Optical Coherence Tomography). This technique provides high accuracy in assessing plaque CSAs (cross section areas) and correlates well with histological sections, which require special and time consuming embedding and sectioning techniques. OCT imaging further allows longitudinal monitoring of the development of in-stent restenosis within the same animal compared to one-time snapshots using histology.

This video demonstrates how to use a preclinical inexpensive and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of in-stent restenosis development. Longitudinal in vivo monitoring using OCT (Optical Coherence Tomography) and analysis of OCT images are also demonstrated.

Imágenes de reestenosis intra-stent: un modelo barato, preclínicos fiable, rápida y

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major clinical challenge because no efficient method exist for their elimination once their dissemination is underway. A better understanding of the mechanisms regulating cancer cell invasion may lead to the development of novel potent therapies. Due to their physiological resemblance to tumors, spheroids embedded in collagen I have been extensively utilized by researchers to study the mechanisms governing cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). However, this assay is limited by (1) a lack of control over the embedding of spheroids into the ECM; (2) high cost of collagen I and glass bottom dishes, (3) unreliable immunofluorescent labeling, due to the inefficient penetration of antibodies and fluorescent dyes and (4) time-consuming image processing and quantification of the data. To address these challenges, we optimized the three-dimensional (3D) spheroid protocol to image fluorescently labeled cancer cells embedded in collagen I, either using time-lapse videos or longitudinal imaging, and analyze cancer cell invasion. First, we describe the fabrication of a spheroid imaging device (SID) to embed spheroids reliably and in a minimal collagen I volume, reducing the assay cost. Next, we delineate the steps for robust fluorescence labeling of live and fixed spheroids. Finally, we offer an easy-to-use Fiji macro for image processing and data quantification. Altogether, this simple methodology provides a reliable and affordable platform to monitor cancer cell invasion in collagen I. Furthermore, this protocol can be easily modified to fit the users&#8217; needs.

Presented here is a protocol for the fabrication of a spheroid imaging device. This device enables dynamic or longitudinal fluorescence imaging of cancer cell spheroids. The protocol also offers a simple image processing procedure for the analysis of cancer cell invasion.

Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

Obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Obtención de imágenes de peróxido mitocondrial en células de levadura vivas mediante mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autor destacado: Avance de la investigación mitocondrial - Biosensor mtHyper7 para análisis subcelular 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Obtención de imágenes de mtHyPer7, un biosensor radiométrico para el peróxido mitocondrial, en células vivas de levadura

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...