Agradecemos ao Dr. Harvey Hensley por seu apoio técnico especializado. Este trabalho beneficiou da utilização dos seguintes Fox Chase Cancer Center (FCCC) instalações: Laboratório de Biotério e Facilidade de imagens de Pequenos Animais. Este trabalho foi financiado em parte pelo SPORE cancro do ovário em FCCC / UPenn (P50 CA083638), o FCCC núcleo de subvenção (P30 CA006927), e do ovário Cancer Research Fund.

I. Preparação das células do tumor de ovário <ol><li> Crescer linhas de células de câncer de ovário expressando luciferase na cultura. Fontes de luciferase pode ser Firefly, Renilla, ou outras espécies. Células que expressam proteínas fluorescentes também podem ser usados. Para esta demonstração, usamos uma linha de células de ovário de câncer, OVCAR5, expressando firefly luciferase. </li><li> Células colheita utilizando a técnica de cultura de células de rotina. </li><li> Manter a suspensão de células (10.000 células / mL) em tampão fosfato salino (PBS) em gelo até o momento da injeção. </li></ol> II. Injeção Intrabursal Este procedimento requer a assistência de uma segunda pessoa. Todos os procedimentos cirúrgicos são realizados sob condições assépticas. Isto inclui vestindo trajes cirúrgicos estéreis e usando instrumentos cirúrgicos, seringas e agulhas. <ol><li> Prepare a solução anestésica através da mistura de 3 mL de cloridrato de cetamina (100 mg / mL), 1,6 mL de cloridrato de xilazina (100 mg / mL), 1,5 mL de acepromazina (10 mg / mL), e 20 mL de cloreto de sódio a 0,9%. </li><li> Verificar o número de identificação do animal e saúde observável. Anestesiar o animal com anestesia cetamina-xilazina-acepromazina preparados via injeção intraperitoneal (ip) com um volume de dose de 8 ~ 9 peso corporal mL / kg (BW). </li><li> Confirmar que o animal está sob uma planície aceitável de anestesia através da realização de uma pitada do dedo do pé com uma pinça ou dedos para patas traseiras do animal. Se houver pedal reflexo, esperar por uma profunda planície de anestesia até que o animal está respondendo a este procedimento. </li><li> Coloque o lado dorsal animais acima em uma gaze estéril com a cabeça virada para fora e sua cauda virada para você. O ponto de incisão está localizado à esquerda ou à direita da linha média e acima dos ovários. Barbear ou molhar a pele com álcool a 70% no ponto de incisão. </li><li> Levante a pele molhada com a pinça e fazer uma pequena incisão com a tesoura na posição dorsomedial e diretamente acima do bloco de ovário de gordura. A almofada de gordura de ovário devem ser visíveis por baixo da superfície da parede peritoneal. Almofada de gordura é facilmente reconhecível pela sua cor branca, em contraste com o tecido rosa escuro que o rodeiam. </li><li> Levante cuidadosamente o revestimento de parede peritoneal e fazer uma pequena incisão, tal como descrito acima (5). </li><li> Coloque uma compressa de gaze estéril embebida salina na linha média adjacente à incisão. Localize a almofada de gordura e de ovário puxe-o suavemente e descansar-lo para a gaze. Estabilizar o ovário apertando a almofada de gordura com um clipe de bulldog. Sob um microscópio de dissecação posição, o ovário a permitir a inserção da agulha (30 gauge, G) a tomada da curva túbulo oviduto levando à bursa. Quando a agulha é inserida na posição correta, deve-se visíveis sob a bursa. </li><li> Com cuidado, empurre o êmbolo da seringa para injectar 5 mL de suspensão celular entre a bursa e do ovário, enquanto a seringa é posicionado no sítio da injecção. Este passo requer duas pessoas. Uma pessoa empurra o êmbolo enquanto a outra pessoa mantém posicionamento da agulha. Retire a agulha rapidamente para selar o local da punção, mas com cuidado suficiente para não rasgar a bursa e túbulo. A bursa deve aparecer a ser ligeiramente distendido com injeção adequada. </li><li> Solte a almofada de gordura do clipe de bulldog e suavemente substituir o trato reprodutivo e volta almofada de gordura na cavidade peritoneal. Feche cuidadosamente a parede do corpo, puxando o revestimento superior sobre a inferior peritoneal forro. Feche a pele com grampos cirúrgicos ou clipes ferida. </li><li> Colocar o animal de volta se recuperando em sua gaiola e fornecer uma fonte de calor seguro para evitar a hipotermia e acelerar a recuperação. Monitorar a taxa de respiração e facilidade, o retorno do tônus ​​muscular, ea capacidade de se mover voluntariamente. Estes são todos os bons indicadores da progressão para a recuperação. Grampos ou clipes de ferida pode ser removido 7 ou mais dias pós-cirurgia. </li></ol> III. Administração Gavage Oral <ol><li> Use uma agulha de 18 ~ 20 G sonda gástrica ou tubo de alimentação com uma ponta arredondada. A agulha sonda não deve ter mais do que a distância da ponta da cabeça do animal para a sua última costela. </li><li> Verificar o número dos animais de identificação e de saúde observável. Suavemente scruff do animal, segurando a pele sobre os ombros com o polegar e os dedos. A contenção deve ser firme o suficiente apenas para os membros tona a ser estendido para cada lado e para fora do caminho. O animal não deve ser capaz de compreender na agulha. </li><li> Puxe para trás a cabeça do animal com o dedo indicador, formando uma linha reta através do pescoço e esôfago. Suporte para as costas do animal com o interior de seu polegar. </li><li> Suavemente e sem força, inserir a agulha gavagem em ambos os lados da boca e sobre a língua. Em um movimento suave, a agulha deve passar contra o céu da boca e para o esôfago. Gravidade deve guiar a agulha para baixo, sem encontrar resistência. Se houver alguma resisce, retire a agulha e começar de novo. Gag do animal e reflexo engolir pode ser desencadeada durante a inserção. No entanto, não deve haver nenhuma resistência ou ofegante do animal. É importante certificar-se que o animal está respirando quando a agulha está no local verificando o movimento das narinas e no peito. </li><li> Lentamente empurre o êmbolo da seringa para dispensar o volume dose. </li><li> Remova cuidadosamente a agulha gavage no mesmo ângulo e via como a forma como foi inserido para o esôfago. </li><li> Devolver o animal para sua gaiola e respiração monitorar e comportamento para 5 ~ 10 minutos. </li></ol> IV. In Vivo de imagem Usamos a Caliper Life Sciences para monitorar o comportamento de células injetadas na cavidade intrabursal. Experimentos usando este sistema normalmente têm um prazo de 4 a 16 semanas a partir do momento da implantação do tumor. <ol><li> Prepare a solução de D-luciferina (substrato de firefly luciferase), dissolvendo 5 ~ 20 mg em 1 mL de PBS e filtragem através de membrana 0,22 mm para esterilização. </li><li> Carregar a câmara de indução por ligar tanto o oxigênio eo gás isoflurano. Ligue o fluxo de gás para a câmara de indução apenas. A taxa de fluxo de isoflurano é mantida em um nível baixo até que os animais estão prontos para ser trabalhada. </li><li> Verificar o número dos animais de identificação e de saúde observável. Colocar o animal na câmara de indução acusado de gás isoflurano. </li><li> Remover o animal da câmara quando o animal parece estar anestesiado. Entregar 200 mL de solução de luciferina preparados via injeção ip com 30 agulha G. É importante registrar o tempo de injeção, a fim de manter o tempo consistente entre luciferina injeção e desempenho de imagem ao longo do estudo. </li><li> Coloque a volta de animais luciferina-injetado na câmara de indução. </li><li> Definir o sistema de imagem para as configurações adequadas. Certifique-se de inicializar o sistema antes de adquirir a imagem primeiro animal. </li><li> Desligue o fluxo de gás para a câmara de indução e ligar o fluxo de gás para a câmara de imagem. </li><li> Coloque o animal anestesiado dorsal ou lateral ventral para cima. Certifique-se de colocar o nariz dos animais em um cone de nariz para manter a indução da anestesia adequada. Verifique se o animal está dentro do &quot;ponto de grade de interesse&quot;, como indicado pela iluminação verde. </li><li> Feche a porta da câmara e adquirir a imagem no momento apropriado. Tempo pode ser determinada pela cinética. </li><li> Remover o animal da câmara de imagem e colocá-lo de volta para sua gaiola. Monitorar a recuperação dos animais conforme descrito em &quot;Injection Intrabursal&quot;. </li></ol> Representante Resultados V. <img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Na geração de imagens Vivo de células tumorais de ovário em um modelo de camundongo ortotópico. OVCAR5 células que expressam luciferase foram injetados intrabursally em ovário direito e representado ao longo do tempo. Imagens foram obtidas 13 (esquerda), 17 (meio) e 22 (direita) dias após a injeção usando o sistema de imagem IVIS Spectrum. Lado dorsal é mostrado no painel superior e no lado ventral está no painel inferior. Note-se que a disseminação peritoneal de células tumorais 22 dias após a injecção. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Cuidados Fox Chase Cancer Center, Animal Institucional e Comitê de uso.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O câncer de ovário é a principal causa de morte entre todas as neoplasias malignas ginecológicas 1. A alta taxa de mortalidade desta doença é em grande parte devido ao seu diagnóstico tardio e à falta de métodos diagnósticos confiáveis ​​2. Além disso, a quimioterapia convencional, muitas vezes encontra quimiorresistência e recidiva de câncer 3. Portanto, o romance de terapêutica é necessária para efetivamente alvo desta doença. No desenvolvimento de novas terapias alvo o câncer de ovário humano, é fundamental para desenvolver um modelo animal representativo. Um modelo animal ortotópico tem vantagens em relação aos modelos convencionais xenoenxerto (por exemplo, subcutânea ou intraperitoneal injeções de células tumorais), em que 1) ele reproduz o principal local de formação de tumores, 2) que representa local comum de metástases, e 3) que proporciona células tumorais para interagir com microambiente apropriado 4, 5, 6, 7, 8. Os roedores possuem uma membrana única bursal que circunda o ovário e é contínua com o oviduto. Esta anatomia única de roedores permite a injeção de células tumorais de ovário ortotopicamente. Células tumorais injetadas Intrabursally ovário se comportam semelhante à doença humana, assim, crescendo dentro da membrana intrabursal e espalhando na cavidade peritoneal como progride tumor. Injeção de células luciferases estável expressando proteínas fluorescentes ou também permite que o comportamento de rastreamento de células tumorais em tempo real. Bioluminescentes e / ou tecnologia de imagens fluorescentes torna possível para as células repetidamente imagem tumor durante um longo período de tempo e estudo do crescimento do tumor, distribuição e regressão não-invasivo maneira 9, 10, 11. Ao estabelecer o modelo ortotópico, é fundamental para remover rapidamente a agulha da bursa após a injecção. Remoção abrupta dos selos agulha do local da punção e impede o vazamento de células injetadas. No entanto, ao mesmo tempo, o movimento deve ser suave para não rasgar o bursa. Se ocorrer uma fuga durante a injeção, pode levar as células a semente no abdômen e potencialmente confundir o estudo, ou seja, prematura se espalhando para fora do ovário. Neste caso, o animal específicas deve ser registrada e seguiu para o desenvolvimento de sites múltiplos tumor no peritônio antes do tratamento ou, alternativamente, eliminados das análises subseqüentes. Antes de realizar gavagem oral, é fundamental para verificar o comprimento do tubo de sonda através da medição da ponta da cabeça do animal para a última costela. É útil para marcar o tubo no nariz do animal e não passar o tubo passado esta marca. Inserção do tubo de passado esta marca pode resultar em uma perfuração no estômago. Determinação do comprimento do tubo é especialmente importante com os animais mais jovens ou animais com peso inferior a 20 g. Após a inserção da agulha sonda para o esôfago, deve haver nenhuma resistência ou luta do animal. É importante não para administrar a solução ou suspensão demasiado rápido, pois isso pode levar ao refluxo e, posteriormente, entregar o volume da dose imprecisos, bem como a adição de estresse para o animal. Para resultados de imagem comparável ao longo do tempo, é desejável para manter o tempo consistente entre a injeção de substrato luciferase e de imagem. O lapso de tempo pode ser determinada tomando série de imagens após a injeção de substrato e observar a cinética de sinais. Desenvolvimento de um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário, entrega oral da droga, e in vivo de imagens são técnicas necessárias para uma melhor compreensão do desenvolvimento e propagação do câncer de ovário e avaliar novos esquemas terapêuticos que pode vir a melhorar o resultado do paciente com esta doença mortal.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

Câncer humano e resposta ao tratamento é melhor representados em modelos animais ortotópico. Este artigo descreve o desenvolvimento de um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário, o tratamento de câncer através da entrega de medicamentos orais e monitoramento do comportamento de células tumorais em resposta ao tratamento medicamentoso em tempo real usando in vivo do sistema de imagem. Neste modelo ortotópico, células de ovário tumor expressar luciferase são aplicados topicamente, injetando-los diretamente na bursa mouse onde cada ovário é fechado. Após a injeção de D-luciferina, um substrato de firefly luciferase, luciferase células que expressam gerar sinais de bioluminescência. Este sinal é detectado pelo sistema de imagens in vivo e permite um meio não invasivo de monitorar o crescimento do tumor, distribuição e regressão em animais individuais. Administração de medicamentos via oral por gavagem permite um volume de dosagem máxima de 10 mL / kg de peso corporal a ser entregue diretamente ao estômago e se assemelha a entrega de drogas em tratamentos clínicos. Portanto, as técnicas descritas aqui, o desenvolvimento de um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário, entrega oral da droga, e in vivo de imagens, são úteis para uma melhor compreensão humana de câncer de ovário e tratamento e vai melhorar o direcionamento desta doença.

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Modelos animais ortotópico de câncer de ovário replicar melhor as doenças humanas e, portanto, melhorar nosso entendimento sobre a progressão do câncer e da resposta do tumor à terapia. Um modelo de camundongo recebe uma injeção de intrabursal luciferase células que expressam tumor de ovário. O tratamento é administrado através de gavagem oral. O crescimento do tumor é monitorado por<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem do sistema.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

in-vivo-imaging-therapeutic-treatments-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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