Dr Harvey Hensley Biz onun uzman teknik destek için teşekkür ederiz. Hayvan Tesis ve Küçük Hayvan Görüntüleme Tesisi Laboratuvarı: Bu çalışma, Fox Chase Kanser Merkezi&#39;nde (FCCC) tesislerinin kullanımı yararlanmıştır. Bu çalışma FCCC / UPenn (P50 CA083638), FCCC çekirdek hibe (P30 CA006927) Yumurtalık Kanseri SPOR ve Yumurtalık Kanseri Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

Over Tümör Hücreleri I. Hazırlık <ol><li> Grow kültür lusiferaz ifade yumurtalık kanseri hücre hatları. Lusiferaz Kaynakları Firefly, Renilla, ya da diğer türler olabilir. Floresan proteinleri ifade Hücreler de kullanılabilir. Bu gösteri için ateşböceği lusiferaz ifade yumurtalık kanseri hücre hattı, OVCAR5, kullanın. </li><li> Rutin hücre kültürü tekniği kullanılarak Hasat hücreleri. </li><li> Fosfat hücre süspansiyonu (10.000 hücre / mcL) enjeksiyon saatine kadar buz üzerinde tamponlu salin (PBS) tutun. </li></ol> II. İntrabursal Enjeksiyon Bu prosedür, ikinci bir kişiden yardım gerektirir. Tüm cerrahi işlemler aseptik koşullarda yapılmaktadır. Bu cerrahi kıyafetleri giyen ve steril cerrahi aletler, şırınga ve iğneler kullanarak içerir. <ol><li> 3 mL ketamin hidroklorür (100 mg / ml), 1.6 ml (100 mg / ml) ksilizin hidroklorür, acepromazine (10 mg / ml) 1.5 ml ve 20 ml% 0.9 sodyum klorür karıştırılarak anestezik çözüm hazırlayın. </li><li> Hayvan kimlik numarası ve gözlemlenebilir sağlık kontrol edin. Ketamin ksilizin-acepromazine hazırlanmış bir doz hacmi 8 ~ 9 ml / kg vücut ağırlığı (BW) ile intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi ile hayvan anestezisi. </li><li> Hayvan hayvanın arka pençeleri forseps veya parmak ile ayak tutam yaparak kabul edilebilir bir ova anestezi altında olduğunu onaylayın. Pedal refleks varsa, hayvan bu prosedüre tepkisiz kadar derin bir anestezi düz bekleyin. </li><li> Hayvan dorsal tarafına kadar steril bir gazlı bezle başını dönük ve kuyruğu size doğru yatırın. Yumurtalıkların üzerinde sol veya sağ ve orta hat kesi noktasında yer almaktadır. Kesi noktada% 70 alkol ile kürk Tıraş veya ıslak. </li><li> Forseps kullanılarak ıslak cilt kaldırın ve makas dorsomedial konumda ve doğrudan over yağ yastığı üzerinde küçük bir kesi yapmak. Over yağ yastığı periton duvar yüzeyinin altında görünür olmalıdır. Fat pad, onu çevreleyen koyu pembe doku aksine beyaz renk ile kolayca tanınabilir. </li><li> Periton duvarını kaplayan yavaşça kaldırın ve yukarıda açıklandığı gibi küçük bir kesi (5). </li><li> Orta hat kesi bitişik batırılmış steril tuzlu gazlı bez yerleştirin. Over yağ yastığı bulun ve yavaşça dışarı çekin ve gazlı bez üzerine geri kalanı. Bulldog klip ile yağ yastığı sıkma yumurtalık sabitleyin. Diseksiyon mikroskobu, pozisyon altında yumurtalık bursa giden yumurtalık tübül viraj içine iğne (30 gauge, G) ekleme için izin vermek. Iğne uygun konuma takıldığında, bursa altında görünür olmalıdır. </li><li> Şırınga enjeksiyon yerinde konumlandırılmış bursa ve yumurtalık arasındaki 5 mcL hücre süspansiyonu enjekte etmek için şırınga pistonu yavaşça itin. Bu adım, iki kişi gerekir. Bir kişi, diğer kişi iğne konumlandırma koruyor pistonu iter. Ponksiyon sitesi mühür hızlı iğne çıkarın ama bursa ve tübül gözyaşı hafifçe yeterli değil. Bursa uygun enjeksiyon biraz şişmiş olarak görünmelidir. </li><li> Bulldog klipten yağ yastığı bırakın ve periton boşluğuna yavaşça üreme yolları ve yağ yastığı arka değiştirin. Alt astar üzerine üst periton astar çekerek vücut duvarı yavaşça kapatın. Cerrahi zımba veya yara klipleri ile cilt kapatın. </li><li> Kendi kafesine geri kurtarma hayvan koyun ve hipotermi önlemek ve kurtarma hızlandırmak için güvenli bir ısı kaynağı sağlar. Monitör, solunum hızı ve kolaylığı, kas tonusu dönüş, ve gönüllü bir hareket yeteneğine. Bu kurtarma yolunda ilerlemesi tüm iyi göstergeleridir. Staples veya yara klipleri, 7 gün veya daha fazla cerrahi sonrası silinebilir. </li></ol> III. Ağızdan sonda İdaresi <ol><li> 18 ~ 20 G sonda ile iğne ya da beslenme tüpü yuvarlak uçlu kullanın. Gavaj iğne hayvanın başının ucundan son kaburga mesafe daha uzun olmamalıdır. </li><li> Hayvanların kimlik numarası ve gözlemlenebilir sağlık kontrol edin. Başparmak ve işaret parmakları ile omuzlar üzerinde cilt tutarak yavaşça berduş hayvan. Kısıtlama, yolun her iki tarafında ve dışarı uzatılabilir ön bacaklar için yeterli sağlam olmalıdır. Hayvan iğne kavramak mümkün olmamalıdır. </li><li> Yavaşça parmağı ile boyun ve yemek borusu ile düz bir çizgi oluşturan, hayvanın kafasını geri çekin. Hayvanın içinde başparmak ile sırt desteği. </li><li> Yavaşça ve kuvvet olmadan, ağız ve dil üzerinden iki tarafında gavaj iğne takın. Tek bir düzgün hareket, iğne ağız ve yemek borusundan aşağı çatı karşı geçmelidir. Yerçekimi toplantı direnişle karşılaşmadan iğne rehberlik etmelidir. Herhangi bir resistan varsace, iğne kaldırmak ve yeniden başlatın. Hayvanın gag ve yutma refleksinin yerleştirilmesi sırasında tetiklenen olabilir. Ancak, hiçbir direniş ya da hayvan nefes nefese olması gerekir. Hayvan iğne burun delikleri ve göğüs hareketi kontrol ederek ne zaman nefes olduğunu emin olmak için çok önemlidir. </li><li> Yavaş yavaş doz hacmi dağıtmak için şırınganın pistonu itin. </li><li> , Yemek borusu takıldı yolu olarak aynı açı ve yolağı gavaj iğne yavaşça çıkarın. </li><li> 5 ~ 10 dakika, kafes ve solunumu ve davranış hayvan dönün. </li></ol> Vivo Görüntüleme IV. Kaliper Yaşam Bilimleri İntrabursal boşluğuna enjekte edilen hücrelerin davranışlarını izlemek için kullanın. Bu sistemi kullanarak deneyler genellikle tümör implantasyonu zaman 4 ~ 16 haftalık bir zaman dilimi var. <ol><li> D-luciferase (ateşböceği lusiferaz substratı) 5 ~ 20 mg 1 ml PBS içinde eriterek ve sterilizasyon için 0.22 mikron zarından filtreleme çözümü hazırlayın. </li><li> Indüksiyon odasına oksijen ve isofluran gaz hem çevirerek şarj edin. Sadece indüksiyon odasına gaz akışı AÇIN. Hayvanlar yansıması için hazır olana kadar izofluran debisi düşük bir düzeyde tutulur. </li><li> Hayvanların kimlik numarası ve gözlemlenebilir sağlık kontrol edin. Isofluran gaz ücret indüksiyon odasında hayvan yerleştirin. </li><li> Hayvan, hayvan anestezi göründüğünde odasından çıkarın. 200 mcL ip enjeksiyon yoluyla 30 G iğne kullanılarak hazırlanmış luciferase çözüm sunun. Çalışma boyunca luciferase enjeksiyon ve görüntü performansı arasındaki zaman tutarlı tutmak için enjeksiyon zamanını kaydetmek için önemlidir. </li><li> Indüksiyon odasına enjekte luciferin-hayvan arkasına yerleştirin. </li><li> Görüntüleme sistemi uygun ayarları ayarlayın. Ilk hayvan görüntü almadan önce sistemi başlatmak için emin olun. </li><li> Indüksiyon odasına gaz akışı KAPATIN ve görüntüleme odasına gaz akışı AÇIK konuma getirin. </li><li> Anestezi hayvan dorsal veya ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Uygun anestezi indüksiyonu korumak için bir burun konisi hayvanların burun yere emin olun. Hayvan yeşil aydınlatma tarafından belirtildiği gibi &quot;faiz grid noktası&quot; içinde olduğundan emin olun. </li><li> Odanın kapısını kapatın ve uygun bir zamanda görüntü elde. Zaman kinetiği tarafından tespit edilebilir. </li><li> Hayvan görüntüleme odasından çıkarın ve onun kafes içine geri koyun. &quot;İntrabursal Enjeksiyon&quot; anlatıldığı gibi hayvanların kurtarma izleyin. </li></ol> V. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 ortotopik bir fare modeli over tümör hücrelerinin Vivo görüntüleme. Lusiferaz ifade OVCAR5 hücreleri sağ yumurtalık intrabursally enjekte edilen ve zaman içinde görüntülenmiş. Görüntüler IVIS Spectrum görüntüleme sistemi kullanarak enjeksiyon gün sonra 13 (solda), 17 (orta) ve 22 (sağ) alınmıştır. Dorsal yüzü üst panelinde gösterilir ve ventral tarafta alt panel. Not tümör hücrelerinin peritoneal yayılım enjeksiyonu takiben 22 gün. Fox Chase Kanser Merkezi&#39;nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

<ol>
	<li>Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li><li>Lynch, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+ovarian+carcinoma:+heterogeneity,+molecular+genetics,+pathology,+and+management.">Hereditary ovarian carcinoma: heterogeneity, molecular genetics, pathology, and management.</a> Mol Oncol. 3, 97-137 (2009).</li><li>Yap, T. A., Carden, C. P., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+chemotherapy:+targeted+therapies+in+ovarian+cancer.">Beyond chemotherapy: targeted therapies in ovarian cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9, 167-181 (2009).</li><li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice.">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).</li><li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation:+advantages+and+disadvantages.">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages.</a> Eur J Cancer. 40, 852-857 (2004).</li><li>Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intraperitoneal,+orthotopic,+and+metastatic+xenograft+models+of+human+ovarian+cancer.">Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer.</a> Mol Ther. 10, 1032-1042 (2004).</li><li>Greenaway, J., Moorehead, R., Shaw, P., Petrik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-stromal+interaction+increases+cell+proliferation,+survival+and+tumorigenicity+in+a+mouse+model+of+human+epithelial+ovarian+cancer.">Epithelial-stromal interaction increases cell proliferation, survival and tumorigenicity in a mouse model of human epithelial ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 108, 385-394 (2008).</li><li>Connolly, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ovarian+cancer.">Animal models of ovarian cancer.</a> Cancer Treat Res. 149, 353-391 (2009).</li><li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging.">Bioluminescence imaging.</a> Proc Am Thorac Soc. 2, 537-540 (2005).</li><li>Lehmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+and+multimodal+in+vivo+imaging+of+tumor+hypoxia+and+its+downstream+molecular+events.">Longitudinal and multimodal in vivo imaging of tumor hypoxia and its downstream molecular events.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 14004-14009 (2009).</li><li>Connolly, D. C., Hensley, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+and+Transgenic+Mouse+Models+of+Epithelial+Ovarian+Cancer+and+Non-Invasive+Imaging+Modalities+to+Monitor+Ovarian+Tumor+Growth+In+Situ:+Applications+in+Evaluating+Novel+Therapeutic+Agents.">Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non-Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In Situ: Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents.</a> Current Protocols in Pharmacoogy. 45, (2009).</li></ol>

Yumurtalık kanseri tüm jinekolojik maligniteler 1 arasında önde gelen ölüm nedenidir. Bu hastalığın yüksek ölüm oranı, geç tanı ve güvenilir tanı yöntemleri 2 eksikliği büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Ayrıca, geleneksel kemoterapi genellikle kanser 3 chemoresistance ve nüks karşılaşır. Bu nedenle, yeni terapötikler bu hastalığın etkin bir şekilde hedef gereklidir. Insan yumurtalık kanseri hedefleyen yeni tedavi geliştirme, temsil eden bir hayvan modeli geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Ortotopik bir hayvan modeli, metastaz ortak sitesi temsil eden), 2 tümör oluşumunu birincil site üretir), geleneksel xenograftlarının modellere göre avantajları şöyle: 1. (örneğin, subkutan ya da tümör hücrelerinin intraperitoneal enjeksiyonu), ve 3), tümör hücrelerinin sağlar uygun mikroçevresinin 4, 5, 6, 7, 8 ile etkileşim. Kemirgenler, yumurtalık çevreleyen ve yumurtalık sürekli eşsiz bir bursal membran var. Kemirgen Bu benzersiz anatomisini orthotopically over tümör hücrelerinin enjeksiyonu sağlar. Böylece İntrabursal zarının içinde büyüyen ve tümör ilerledikçe periton boşluğuna yayılan Intrabursally enjekte over tümör hücrelerinin, insan hastalığına benzer şekilde davranırlar. Hücreleri stabil bir şekilde ifade luciferases veya floresan proteinlerle enjeksiyon da, gerçek zamanlı olarak tümör hücrelerinin izleme davranışı sağlar. Bioluminescent ve / veya floresan görüntüleme teknolojisi sayesinde, zaman ve non-invaziv bir şekilde 9, 10, 11 çalışma tümör büyümesi, dağıtım ve regresyon uzun bir süre boyunca sürekli görüntü tümör hücreleri yapar. Ortotopik modeli kuran, hızlı enjeksiyon üzerine bursa iğneyi çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Ani iğne mühürler ponksiyon sitesi çıkarılması ve enjekte edilen hücrelerin dışarıya sızmasını önler. Ancak, aynı zamanda, hareketin bursa gözyaşı nazik olmalıdır. Enjeksiyon sırasında sızıntı meydana gelirse, karın içinde tohum hücreleri neden ve olası erken yumurtalık dışına yayılan çalışma, yani bulandırabilir. Bu durumda, belli bir hayvan kaydedildi ve periton tedavisi ya da alternatif sonraki analizlerde elimine önce birden fazla tümör sitelerinin gelişimi için takip. Ağızdan sonda gerçekleştirmeden önce, bu hayvanın başının ucundan son kaburga ölçerek gavaj tüpün uzunluğu kontrol etmek için kritik öneme sahiptir. Hayvan burnu tüp işaretlemek için yararlı olur ve bu işareti geçmiş tüp geçemiyor. Bu işareti geçmiş tüpün yerleştirilmesi, mide perforasyonu neden olabilir. Tüpün uzunluğu Belirlenmesi 20 kapsamında gr ağırlığında küçük hayvanlar veya hayvanların özellikle önemlidir. Yemek borusundan aşağı gavaj iğne yerleştirilmesi üzerine, hiçbir direniş ya da hayvan mücadele olmalıdır. Bu reflüye yol ve daha sonra yanlış doz hacmi teslim yanı sıra hayvan stres ekleyerek gibi çözeltisi veya süspansiyonu çok hızlı bir şekilde yönetmek için önemlidir. Zaman zaman karşılaştırılabilir görüntüleme sonuçlar için, lusiferaz substrat ve görüntüleme enjeksiyonu arasındaki zaman tutarlı tutmak için arzu edilir. Substrat enjeksiyondan sonra dizi görüntü sinyalleri kinetiği dikkate alarak ve zaman atlamalı tespit edilebilir. Yumurtalık kanseri gelişimi ve yayılması daha iyi anlaşılması ve değerlendirilmesi, sonuçta, bu ölümcül hastalığı olan hasta sonucu artırabilir yeni tedavi rejimleri, yumurtalık kanseri, oral ilaç teslimat ve in vivo görüntüleme ortotopik fare modeli geliştirilmesi gerekli teknikleri.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

İnsan kanser ve tedaviye yanıt ortotopik hayvan modellerinde daha iyi temsil edilmektedir. Bu makale, yumurtalık kanseri ortotopik fare modelinde, in vivo görüntüleme sistemi kullanarak gerçek zamanlı olarak ilaç tedavisine yanıt tümör hücresi davranış oral ilaçlar teslim ve izleme ile kanser tedavisi gelişme açıklamaktadır . Bu ortotopik modeli, lusiferaz ifade over tümör hücrelerinin her yumurtalık içine fare bursa içine doğrudan enjekte edilerek topikal olarak uygulanır. D-luciferase, ateşböceği lusiferaz bir substrat enjeksiyon üzerine, lusiferaz ifade hücreleri biyoparlaklık sinyaller oluşturur. Bu sinyal in vivo görüntüleme sistemi tarafından tespit edilir ve bireysel hayvanlarda tümör büyümesini, dağıtım ve regresyon izleme non-invaziv bir araç sağlar . Maksimum doz hacmi için 10 ml / kg vücut ağırlığı mide doğrudan teslim edilmek üzere bir ağızdan sonda ile ilaç yönetimi sağlar ve klinik tedavilerde ilaçlar teslim yakından benzer. Bu nedenle, teknikleri, burada, yumurtalık kanseri, oral ilaç teslimat ve in vivo görüntüleme ortotopik fare modeli geliştirme açıklanan insan yumurtalık kanseri ve tedavi daha iyi anlaşılması için yararlı olur ve bu hastalık hedefleyen artıracaktır.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer at JoVE.com

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Yumurtalık kanseri Ortotopik hayvan modellerinde daha iyi insan hastalığı çoğaltmak ve bu nedenle kanser progresyonu ve tedaviye tümör yanıt anlayışımızı geliştirmek. Bir fare modelinde lusiferaz ifade over tümör hücrelerinin bir İntrabursal enjeksiyon alır. Tedavi ağızdan sonda ile yönetilmektedir. Tümör büyüme izlenir<em&gt; In vivo</em&gt; Görüntüleme sistemi.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

in-vivo-imaging-therapeutic-treatments-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

33.1K Görüntüleme.  Women's Cancer Program.  中文 

Video: In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Kolorektal Kanser Ortotopik Fare Modeli

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

Biyoloji

Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and future drug-eluting stents.
A variety of antibodies and transgenic and knockout strains are available in rats. Consequently, a model for in-stent restenosis in the rat would be convenient for pathobiological and pathophysiological studies. 
In this video, we present the full procedure and pit-falls of a rat stent model suitable for high throughput stent research. We will show the surgical procedure of stent deployment, and the assessment of in-stent restenosis using the most elegant technique of OCT (Optical Coherence Tomography). This technique provides high accuracy in assessing plaque CSAs (cross section areas) and correlates well with histological sections, which require special and time consuming embedding and sectioning techniques. OCT imaging further allows longitudinal monitoring of the development of in-stent restenosis within the same animal compared to one-time snapshots using histology.

This video demonstrates how to use a preclinical inexpensive and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of in-stent restenosis development. Longitudinal in vivo monitoring using OCT (Optical Coherence Tomography) and analysis of OCT images are also demonstrated.

Görüntüleme-stent restenoz: Ucuz, güvenilir ve hızlı bir Preklinik Modeli

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major clinical challenge because no efficient method exist for their elimination once their dissemination is underway. A better understanding of the mechanisms regulating cancer cell invasion may lead to the development of novel potent therapies. Due to their physiological resemblance to tumors, spheroids embedded in collagen I have been extensively utilized by researchers to study the mechanisms governing cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). However, this assay is limited by (1) a lack of control over the embedding of spheroids into the ECM; (2) high cost of collagen I and glass bottom dishes, (3) unreliable immunofluorescent labeling, due to the inefficient penetration of antibodies and fluorescent dyes and (4) time-consuming image processing and quantification of the data. To address these challenges, we optimized the three-dimensional (3D) spheroid protocol to image fluorescently labeled cancer cells embedded in collagen I, either using time-lapse videos or longitudinal imaging, and analyze cancer cell invasion. First, we describe the fabrication of a spheroid imaging device (SID) to embed spheroids reliably and in a minimal collagen I volume, reducing the assay cost. Next, we delineate the steps for robust fluorescence labeling of live and fixed spheroids. Finally, we offer an easy-to-use Fiji macro for image processing and data quantification. Altogether, this simple methodology provides a reliable and affordable platform to monitor cancer cell invasion in collagen I. Furthermore, this protocol can be easily modified to fit the users&#8217; needs.

Presented here is a protocol for the fabrication of a spheroid imaging device. This device enables dynamic or longitudinal fluorescence imaging of cancer cell spheroids. The protocol also offers a simple image processing procedure for the analysis of cancer cell invasion.

3D Sferoid Modelinde Zaman Çözülen Floresan Görüntüleme ve Kanser Hücre İstilasının Analizi

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler