Ringraziamo il Dr. Harvey Hensley per il suo supporto tecnico. Questo lavoro ha beneficiato l&#39;uso dei seguenti Fox Chase Cancer Center (FCCC) impianti: Laboratorio di Fondo e degli animali di piccola strumento Imaging animali. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal SPORE Ovarian Cancer FCCC / UPenn (P50 CA083638), il FCCC nucleo di sovvenzione (P30 CA006927) e il Fondo di cancro ovarico di ricerca.

I. Preparazione di cellule di tumore ovarico <ol><li> Crescere ovarico linee di cellule tumorali che esprimono luciferasi in coltura. Fonti di luciferasi può essere Firefly, Renilla, o altre specie. Cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti può anche essere usato. Per questa dimostrazione si utilizza un cancro ovarico linea cellulare, OVCAR5, esprimendo lucciola luciferasi. </li><li> Cellule vendemmia utilizzando di routine la tecnica di coltura cellulare. </li><li> Tenere la sospensione cellulare (10.000 cellule / mL) in tampone fosfato (PBS) in ghiaccio fino al momento dell&#39;iniezione. </li></ol> II. Iniezione Intrabursal Questa procedura richiede l&#39;assistenza di una seconda persona. Tutte le procedure chirurgiche sono condotti in condizioni asettiche. Questo include indossare abbigliamento chirurgico e l&#39;utilizzo di strumenti chirurgici sterili, siringhe e aghi. <ol><li> Preparare la soluzione anestetica mescolando 3 ml di ketamina cloridrato (100 mg / ml), 1,6 mL di xilazina cloridrato (100 mg / ml), 1,5 mL di acepromazina (10 mg / mL), e 20 ml di sodio cloruro 0,9%. </li><li> Controllare il numero di identificazione dell&#39;animale e la salute osservabili. Anestetizzare l&#39;animale preparato con ketamina-xylazina-acepromazina anestesia via intraperitoneale (ip) di iniezione con una dose da 8 e 9 ml / kg di peso corporeo (BW). </li><li> Confermano che l&#39;animale si trova sotto una pianura accettabile di anestesia eseguendo un pizzico dito del piede con una pinza o dita per le zampe posteriori dell&#39;animale. Se c&#39;è pedale riflesso, attendere una più profonda pianura di anestesia finché l&#39;animale non risponde a questa procedura. </li><li> Posare il lato dorsale animale su un tampone di garza sterile con la testa rivolta verso la coda e rivolto verso di voi. Il punto di incisione si trova a sinistra oa destra della linea mediana e sopra le ovaie. Shave o bagnare il pelo con il 70% di alcool nel punto dell&#39;incisione. </li><li> Sollevare la pelle a contatto con pinze e fare una piccola incisione con la forbice in posizione dorsomediale e direttamente sopra il cuscinetto di grasso ovarico. Il cuscinetto adiposo ovarico dovrebbe essere visibile sotto la superficie della parete peritoneale. Cuscinetto adiposo è facilmente riconoscibile dal colore bianco in contrasto con il tessuto rosa scuro che lo circonda. </li><li> Sollevare delicatamente il rivestimento peritoneale muro e fare una piccola incisione come descritto in precedenza (5). </li><li> Posizionare un tampone imbevuto di garza sterile salina sulla linea mediana adiacente alla incisione. Individuare il cuscinetto adiposo ovarico e tirarlo fuori e appoggiarla sulla garza. Stabilizzare l&#39;ovaia dalla chiusura del cuscinetto adiposo con una clip bulldog. Sotto un microscopio a dissezione, posizionare l&#39;ovaio da consentire l&#39;inserimento dell&#39;ago (30 gauge, G) in curva tubulo ovidotto che porta alla borsa. Quando l&#39;ago viene inserito nella posizione corretta, dovrebbe essere visibile sotto la borsa. </li><li> Premere delicatamente il pistone della siringa per iniettare 5 ml di sospensione cellulare tra la borsa e l&#39;ovaio, mentre la siringa è posizionato al sito di iniezione. Questa fase richiede due persone. Una persona spinge il pistone, mentre l&#39;altra persona mantiene il posizionamento dell&#39;ago. Rimuovere velocemente l&#39;ago per sigillare il sito della puntura, ma delicatezza sufficiente a non strappare la borsa e tubulo. La borsa dovrebbe apparire leggermente disteso con iniezione appropriate. </li><li> Rilasciare il cuscinetto adiposo dalla clip bulldog e delicatamente sostituire il tratto riproduttivo e ritorno cuscinetto adiposo nella cavità peritoneale. Chiudere delicatamente la parete del corpo tirando il rivestimento superiore peritoneale il rivestimento inferiore. Chiudere la pelle con punti metallici o clip ferita chirurgica. </li><li> Posizionare l&#39;animale recupero indietro nella sua gabbia e fornire una fonte sicura di calore per evitare ipotermia e accelerare la ripresa. Monitorare la frequenza respiratoria e la facilità, il ritorno del tono muscolare e la capacità di muoversi volontariamente. Questi sono tutti buoni indicatori della progressione verso la guarigione. Punti metallici o clip ferita può essere rimosso o superiore a 7 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> III. Orale Amministrazione Gavage <ol><li> Utilizzare un ~ 18 20 ago sonda G o sondino per l&#39;alimentazione con una punta arrotondata. L&#39;ago sonda gastrica deve essere più lungo rispetto alla distanza dalla punta della testa dell&#39;animale alla sua costola. </li><li> Controllare il numero di identificazione degli animali &#39;e la salute osservabili. Delicatamente collottola l&#39;animale afferrando la pelle sopra le spalle con il pollice e le dita. Il sistema di ritenuta deve essere solo abbastanza solida per gli arti anteriori per essere esteso a ogni lato e fuori del modo. L&#39;animale non deve essere in grado di afferrare l&#39;ago. </li><li> Delicatamente tirare indietro la testa dell&#39;animale con il dito indice, formando una linea diritta attraverso il collo ed esofago. Supporto posteriore dell&#39;animale con l&#39;interno del vostro pollice. </li><li> Delicatamente e senza forza, inserire l&#39;ago gavage su entrambi i lati della bocca e sulla lingua. In un movimento fluido, l&#39;ago deve passare contro il tetto della bocca e giù per l&#39;esofago. Gravità dovrebbe guidare l&#39;ago verso il basso senza resistenza riunione. Se c&#39;è una resisce, togliere l&#39;ago e ricominciare. Gag dell&#39;animale e riflesso ingoiare può essere attivato durante l&#39;inserimento. Tuttavia, ci dovrebbe essere nessuna resistenza o gasping dall&#39;animale. E &#39;importante assicurarsi che l&#39;animale sta respirando quando l&#39;ago è in posizione controllando il movimento delle narici e al torace. </li><li> Spingere lentamente lo stantuffo della siringa per erogare il volume della dose. </li><li> Rimuovere delicatamente l&#39;ago sonda gastrica con lo stesso angolo e via come il modo in cui è stato inserito verso il basso l&#39;esofago. </li><li> Rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia e la respirazione monitorare e comportamenti per 5 ~ 10 minuti. </li></ol> IV. Imaging in vivo Usiamo il Caliper Life Sciences di monitorare il comportamento delle cellule iniettate nella cavità intrabursal. Gli esperimenti che utilizzano questo sistema in genere hanno un orizzonte temporale di 4 a 16 settimane dal momento dell&#39;impianto del tumore. <ol><li> Preparare la soluzione di D-luciferina (substrato di lucciola luciferasi), sciogliendo 5 ~ 20 mg in 1 ml di PBS e il filtraggio attraverso membrane 0,22 micron per la sterilizzazione. </li><li> Caricare la camera di induzione attivando sia l&#39;ossigeno e il gas isoflurano. Accendere il flusso di gas alla camera di induzione solo. La portata isoflurano è mantenuta a un livello basso fino a quando gli animali sono pronti per essere ripreso. </li><li> Controllare il numero di identificazione degli animali &#39;e la salute osservabili. Posto l&#39;animale in camera di induzione carica di gas isoflurano. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dalla camera quando l&#39;animale sembra essere anestetizzati. Fornire 200 ml di soluzione di luciferina preparata mediante iniezione ip utilizzando 30 ago G. E &#39;importante registrare il tempo di iniezione in modo da mantenere costante il tempo tra l&#39;iniezione luciferina e prestazioni di imaging tutto lo studio. </li><li> Posizionare la luciferina-iniettati di nuovo animale nella camera di induzione. </li><li> Impostare il sistema di imaging per le impostazioni appropriate. Assicurati di inizializzare il sistema prima di acquistare la prima immagine animale. </li><li> Spegnere il flusso di gas alla camera di induzione e accendere il flusso di gas alla camera di imaging. </li><li> Posizionare la dorsale anestetizzato animale o lato ventrale in su. Assicurarsi di posizionare il naso degli animali &#39;in un cono naso per mantenere la corretta induzione dell&#39;anestesia. Assicurarsi che l&#39;animale si trova il &quot;punto della griglia di interesse&quot;, come indicato da illuminazione verde. </li><li> Chiudere la porta della camera e acquisire l&#39;immagine al momento opportuno. Il tempo può essere determinato dalla cinetica. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dalla camera di imaging e metterlo di nuovo nella sua gabbia. Monitorare il recupero degli animali &#39;come descritto in &quot;iniezione Intrabursal&quot;. </li></ol> V. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Imaging in vivo di cellule del tumore ovarico in un modello murino ortotopico. OVCAR5 cellule che esprimono luciferasi sono state iniettate in intrabursally ovaia destra e ripreso nel corso del tempo. Le immagini sono state prese 13 (a sinistra), 17 (centro) e 22 (a destra) giorni dopo l&#39;iniezione con il sistema Spectrum IVIS imaging. Lato dorsale è mostrato nel pannello superiore e laterale ventrale è in basso del pannello. Si noti che la diffusione peritoneale di cellule tumorali 22 giorni dopo l&#39;iniezione. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali istituzionali Fox Chase Cancer Center e del comitato Usa.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il cancro ovarico è la principale causa di morte tra tutte le neoplasie ginecologiche 1. L&#39;alta mortalità di questa malattia è in gran parte a causa della sua diagnosi tardiva e la mancanza di affidabili metodi diagnostici 2. Inoltre, la chemioterapia convenzionale incontra spesso chemioresistenza e recidiva di tumore 3. Pertanto, il romanzo di terapie è necessario per raggiungere in modo efficace questa malattia. Nello sviluppo della nuova terapia per il cancro ovarico umano, è fondamentale per sviluppare un modello rappresentativo di animali. Un modello animale ortotopico ha dei vantaggi rispetto ai modelli convenzionali xenotrapianto (ad esempio per via sottocutanea o iniezioni intraperitoneali di cellule tumorali) in quanto 1) riproduce il sito primario di formazione del tumore, 2) rappresenta il sito comune di metastasi, e 3) che fornisce le cellule tumorali a interagire con microambiente appropriato 4, 5, 6, 7, 8. Roditori hanno una membrana unica della borsa che circonda l&#39;ovaio e si continua con l&#39;ovidotto. Questa anatomia unica di roditori permette l&#39;iniezione di cellule tumorali ovariche ortotopicamente. Intrabursally iniettato cellule di tumore ovarico si comportano simile alla malattia umana, in tal modo crescente all&#39;interno della membrana intrabursal e la diffusione in cavità peritoneale con il progredire del tumore. Iniezione di luciferases cellule che esprimono stabilmente o proteine ​​fluorescenti consente anche il monitoraggio del comportamento delle cellule tumorali in tempo reale. Bioluminescenti e / o tecnologia di imaging a fluorescenza consente di volte le cellule tumorali immagine per un lungo periodo di tempo e studio della crescita tumorale, la distribuzione e la regressione in modo non invasivo 9, 10, 11. Nel definire il modello ortotopico, è fondamentale per rimuovere rapidamente l&#39;ago dalla borsa dopo l&#39;iniezione. La rimozione dei sigilli brusca ago della puntura e previene la perdita di cellule iniettate. Tuttavia, allo stesso tempo, il movimento deve essere dolce a non strappare la borsa. Se la perdita si verifica durante l&#39;iniezione, può indurre le cellule a seme nel ventre e potenzialmente confondere lo studio, cioè, prematura diffusione al di fuori dell&#39;ovaio. In questo caso, l&#39;animale specifico dovrebbe essere registrato e seguiti per lo sviluppo di siti tumorali più nel peritoneo prima del trattamento o, in alternativa eliminati dalle analisi successive. Prima di eseguire sonda gastrica, è fondamentale per verificare la lunghezza del tubo sonda gastrica misurando dalla punta della testa dell&#39;animale e l&#39;ultima costa. E &#39;utile per segnare il tubo al naso dell&#39;animale e non passare il tubo passato questo marchio. Inserimento del tubo passato questo marchio può provocare una perforazione nello stomaco. Determinare la lunghezza del tubo è particolarmente importante con animali più giovani o animali di peso inferiore a 20 gr Al momento l&#39;inserimento dell&#39;ago gavage giù nell&#39;esofago, ci dovrebbe essere nessuna resistenza o lotta dall&#39;animale. E &#39;importante non somministrare la soluzione o sospensione troppo veloce come questo può portare a reflusso e successivamente consegnare il volume inesatte dose, così come l&#39;aggiunta di stress per l&#39;animale. Per ottenere risultati confrontabili immagini di tanto in tanto, è auspicabile per mantenere il tempo coerente tra iniezione di substrato luciferasi e di imaging. Il lasso di tempo può essere determinato prendendo serie di immagini dopo l&#39;iniezione del substrato e osservare la cinetica dei segnali. Sviluppo di un modello di topo ortotopico di cancro ovarico, somministrazione orale di farmaci, e in vivo imaging sono le tecniche necessarie per una migliore comprensione dello sviluppo e la diffusione del cancro ovarico e valutare nuovi regimi terapeutici che possono in ultima analisi, migliorare il risultato del paziente affetto da questa malattia mortale.

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

Cancro umano e la risposta alla terapia è meglio rappresentati in modelli animali ortotopico. Questo articolo descrive lo sviluppo di un modello di topo ortotopico di cancro ovarico, trattamento del cancro attraverso somministrazione orale di farmaci e il monitoraggio del comportamento delle cellule tumorali in risposta al trattamento farmacologico in tempo reale utilizzando nel sistema di imaging in vivo. In questo modello ortotopico, le cellule del tumore ovarico che esprimono luciferasi vengono applicati localmente iniettando direttamente nella borsa del mouse in cui è racchiuso ogni ovaio. Su iniezione di D-luciferina, un substrato di lucciola luciferasi, luciferasi cellule che esprimono generare segnali bioluminescenza. Questo segnale viene rilevato dal sistema in vivo imaging e consente una non invasivo mezzi di controllo della crescita tumorale, la distribuzione e la regressione nei singoli animali. Somministrazione del farmaco tramite sonda gastrica consente un volume di dosaggio massimo di 10 ml / kg di peso corporeo da consegnare direttamente allo stomaco e ricorda da vicino la consegna di farmaci nei trattamenti clinici. Pertanto, le tecniche descritte qui, lo sviluppo di un modello di topo ortotopico di cancro ovarico, somministrazione orale di farmaci, e imaging in vivo, sono utili per una migliore comprensione del cancro ovarico umano e trattamento e migliorare il targeting questa malattia.

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Ortotopico modelli animali di cancro ovarico meglio replicare la malattia umana e, pertanto, migliorare la nostra comprensione della progressione del cancro e la risposta del tumore alla terapia. Un modello di topo riceve una iniezione intrabursal della luciferasi che esprimono le cellule tumorali ovariche. Il trattamento è somministrato tramite sonda gastrica. La crescita tumorale è controllato da<em&gt; In vivo</em&gt; Immagine di sistema.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

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Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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