Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones NS-DK 38849 y 076160, la Juvenile Diabetes Research Foundation Center para el Estudio de las Complicaciones de la Diabetes, el Programa de Neurología de investigación y descubrimiento y la A. Alfred Taubman Instituto de Investigación Médica en el Universidad de Michigan. Este trabajo utiliza la morfología y Core Image Análisis del Centro Michigan de Investigación de Diabetes y de formación, financiados por los Institutos Nacionales de Salud Grant 5P60 DK-20572 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales. Los autores agradecen a Scott T. Clarke de sondas moleculares / Invitrogen por su valioso asesoramiento sobre los diversos clic en él Edu etiquetado kits y la generosa donación de reactivos para apoyar el desarrollo inicial de la técnica de amplificación de Edu.

1. Preparación de las neuronas <ol><li> Ganglio de la raíz dorsal (DRG), las neuronas se cultivan en estéril (autoclave) 12 mm cubreobjetos de vidrio en una placa de cultivo de 24 pocillos. </li><li> El stock de 10 mM de Educación (en DMSO, clic en él Edu microplacas Kit de ensayo) es normalmente diluido 1:100 en medio de cultivo para hacer una solución de Edu 10X (100 mM) y luego se diluyó 1:10 en la cultura de los pozos (por ejemplo, 30 l de la solución de Edu 10 veces en un total de 300 L de medio de cultivo). DRG neuronas se incubaron con una concentración final de Edu M 10 a 37 ° C y 5% de CO 2 entre 2-24 horas. La cantidad de tiempo depende de cómo los tratamientos afectan a la velocidad de síntesis de ADN mitocondrial. </li><li> En una campana de extracción, las neuronas DRG se fijan en paraformaldehído al 2% durante 10-15 minutos a temperatura ambiente, se lavan dos veces en PBS 1X 2-5 minutos de cada lavado y almacenado en PBS 1X durante un máximo de 1 mes a 4 ° C. </li><li> Cubreobjetos se transfieren con pinzas de punta fina a una cámara húmeda preparada (plato Corning BioAssay con fondo negro empapelado para el contraste, envuelto en papel de aluminio para proteger los componentes sensibles a la luz y humedecido con agua saturada Kimwipes) y se coloca en una lámina de Parafilm M que proporciona una superficie hidrofóbica para confinar las soluciones a los cubreobjetos. El protocolo a continuación está diseñado para 28 cubreobjetos y las soluciones se preparan para el 32 cubreobjetos (alrededor del 14% del volumen extra). Soluciones con componentes caros o limitados se hacen para que l 75-80 se utilizan en cada portaobjetos. De lo contrario, 200-300 l se utilizan para las soluciones de lavado y el bloque que se laven las soluciones anteriores. </li><li> Vuelva a aplicar 1X PBS para cubrir la superficie de cada cubreobjetos (200-300 l). Preparar el ensayo clic en él y tyramide kits amplificación de la señal como se describe a continuación y en las instrucciones del fabricante. </li></ol> Preparación de clic en él Edu Kit de ensayo de microplacas La mayoría de los componentes del Kit clic en él Edu Microplacas vienen pre-hechos y se almacenan a 4 ° C [2x clic en él tampón de reacción (componente E 10x), CuSO4 (100 mM, componente F), clic en él Edu fijador ( Buffer componente D) y bloqueo (2x componente H)]. Clic en él aditivo Buffer Edu (10x componente G) se almacenan a -20 ° C para evitar que se vuelvan de color amarillo-marrón con el tiempo. Este componente tolera repetidos ciclos de congelación y descongelación. El Oregon Green 488 azida (componente B) se debe dividir en pequeñas alícuotas (10-20 l) para reducir al mínimo los ciclos de congelación-descongelación y se almacenan a -20 ° C. Para preparar una solución madre de la anti-Oregon conjugado HRP Verde (Componente I), añadir 75 l de agua Milli Q dH 2 O en el vial. Mezclar por pipeteo suave o dándole la vuelta para evitar la formación de espuma y se almacenan a 4 ° C. No vórtice. Preparación de la TSA Kit # 12, con HRP de cabra anti-IgG de conejo y Alexa Fluor 488 Kit tiramida Para preparar la solución madre tyramide, disolver el material sólido (Alexa Fluor 488 tyramide, Componente A) en 150 l de DMSO (Componente B). Invertir el frasco varias veces para disolver cualquier recubrimiento tyramide los lados del vial. Solución de tienda de valores en pequeñas alícuotas (10-20 l) a ≤ -20 ° C, desecado y protegido de la luz. 2. Clic en ella 5-etinil-2-desoxiuridina (EDU) de etiquetado NOTA: Todas las soluciones se eliminan con una pipeta de transferencia bombilla con una punta de 200 l fijado hasta el final para eliminar suavemente las células de los líquidos sin perder. Evite el uso de una línea de vacío, que suele quitar las soluciones con demasiada fuerza. Una pipeta de bulbo se utiliza para inundar suavemente cubreobjetos con 200-300 L de las soluciones de lavado para lavar a fondo con la solución anterior. <ol><li> Las células se permeabilized con 0,1% Triton X-100-1X en la solución de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente en una cámara cubierta húmeda. Destinar el 1% Triton-X-100 soluciones madre. <ul><li> Hacer 3.000 l de 0,1% Tritón-X-100 mediante la adición de 300 L 1% Tritón-X-100 en stock para 2700μL 1X PBS. </li><li> Use 75-80 L por tapar. </li></ul></li><li> Retire el Triton X-100 solución y enjuagar dos veces con PBS 1X. </li><li> La actividad peroxidasa endógena se apaga por un 1% H 2 O 2 en la solución 1X PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Diluir 30% de H 2 O 2 con solución PBS 1X. Esta solución debe ser fresca, pero se puede hacer durante el paso de permeabilización de 10 minutos por encima de (paso 3.1). <ul><li> Hacer 3.000 l de un 1% H 2 O 2 mediante la adición de 100 l 30% de H 2 O 2 hasta 2900 l de PBS 1X. </li><li> Use 75-80 L por tapar. </li><li> Eliminar la solución de peroxidasa y enjuague dos veces con PBS 1X. </li></ul></li><li> Clic en él Edu reacción <ul><li> El 32 cubreobjetos (32 x 80 = l2.560 l) de un total de 2.560 l es necesario. La reacción se realiza 2 veces en el año 1280 l, que es la mitad del volumen total de la reacción. </li><li> Recién preparar el cóctel de reacción clic en él antes de iniciar la solución después de 5 minutos (paso 3.5). </li><li> Mezcla el cóctel pipeteando arriba y hacia abajo. No vórtice al hacer esta reacción. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 x cóctel de reacción Los componentes son de clic en él Edu Kit de ensayo de microplacas </td><td> La mitad del volumen: 1.280 l </td></tr><tr><td> Milli Q dH 2 O </td><td> 1132,8 l </td></tr><tr><td> 2x clic en él tampón de reacción (componente E 10x) </td><td> 100,3 l </td></tr><tr><td> Clic en él Edu aditivo Buffer (G componente 10 veces) </td><td> 25,6 l </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 mm, F de componentes) </td><td> 25,6 l </td></tr><tr><td> Oregon Green azida (un componente) </td><td> 6,4 l </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1290,7 l </td></tr></tbody></table> NOTA: Los volúmenes utilizados por encima son proporcionales a los volúmenes que figuran en las direcciones que Click-Edu kit de ensayo de microplacas. El volumen final del cóctel de reacción es un poco más de 1.280 mL. </li><li> El clic en él 2X de reacción se diluyó con igual volumen de clic en él Edu fijador (componente D) justo antes de su uso. Mezclar estas dos hace una solución de reacción uniforme para todos los cubreobjetos. </li><li> Añadir 1290,7 l clic en él Edu fijador (componente D) para el cóctel de reacción 1290,7 mL. Use 75-80 L por tapar. </li></ul></li><li> Después de arreglar las neuronas con clic en él Edu fijador (componente D) durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar revisión y añadir cóctel de reacción a la anterior (paso 3.4). Cubierta para proteger de la luz y se incuba durante 25 minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado el cóctel de reacción. Lavar dos veces con Buffer diluido 1X bloqueo (2X componente H). <ul><li> Hacer 5.200 l de 1X tampón de bloqueo mediante la dilución de 2.600 l de búfer de bloqueo (2x componente H) con un volumen igual de MilliQ d H 2 O (2600 l). Use 75-80 L por tapar. </li></ul></li><li> Bajo un microscopio epi-fluorescente, revise Oregon manchas verdes en los núcleos de las células de control de actividad mitótica. </li></ol> 3. Tiramida amplificación de la señal (TSA) de Educación de señal <ol><li> Agregar solución al 1% a cada bloque de TSA cubreobjetos y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. <ul><li> Hacer l 6000 de la solución de bloqueo del 1% TSA pesando 0,06 g de reactivo de bloqueo de la TSA (TSA # 12 kit, componente D) y agregarlo a 6.000 l de PBS 1X. Vortex para mezclar. Además de suero de cabra al 5% en la solución de bloqueo del 1% de TSA a menudo ayuda a reducir la unión no específica. </li></ul></li><li> En pocas palabras girar la anti-Oregon Green acciones peroxidasa conjugado (Componente I del ensayo clic en él Edu microplacas), preparado 2-24 horas antes de la TSA. Diluir el anticuerpo primario 1:300 en solución al 1% e invertir el bloqueo de la TSA o una pipeta hacia arriba y abajo suavemente para mezclar. No vórtice a fin de no perturbar el anticuerpo conjugado con HRP. Quitar el 1% solución bloque TSA, añadir 75 l de cada cubreobjetos y se incuba durante la noche a 4 ° C. <ul><li> El anticuerpo se puede utilizar más concentrado, como 1:150, pero que se suministra en cantidades limitadas, por lo que utilizar con moderación. Una vez más, la adición de suero de cabra al 5% en la solución de bloqueo del 1% de TSA a menudo ayuda a reducir la unión no específica del anticuerpo anti-Oregon Green peroxidasa de rábano conjugada. </li><li> Hacer 2.560 l de una solución de anticuerpos 1:300 añadiendo 8,53 l del conejo acciones anti-Oregon Green-HRP (Click-iT Edu microplacas de ensayo) a 2560 l 1% de bloqueo de la TSA. Mezclar por pipeteo suave o inversión. </li></ul></li><li> Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos y enjuáguese la boca tres veces con PBS 1X. Incubar los cubreobjetos en el lavado final por otros 30-60 minutos a temperatura ambiente para asegurar que el anticuerpo no fijado principal sea removida. </li><li> Prepare reacción tiramida de 2560 l (32 x 80 cubreobjetos l). <ul><li> Hacer 400 l de un 0,15% de H 2 O 2 solución (100X) mediante la adición de 2 l de 30% H 2 O 2 (TSA kit n. º 12, de componente F) a 398 l tampón de amplificación (TSA # 12 kit, componente E) . Esto debe hacerse justo antes de que sea necesario. </li><li> Para un volumen final de 2560 l se combinan: <ul><li> 25.6 tiramida-488 l (TSA Juego de componentes A) </li><li> 2.508,8 Buffer amplificación l (TSA E Juego de componentes) </li><li> 25,6 l 0,15% de H 2 O 2 (de arriba para una final de 0,0015% H 2 O 2) </li><li> Quitar 1X PBS e incubar la reacción tiramida durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li></ul></li></ul></li><li> Quitar reacción tiramida y enjuague tres veces con PBS 1X, la incubación en el lavado final por 30-60 minutos a temperatura ambiente, como antes. </li><li> Compruebe que el etiquetado del ADNmt en un microscopio epi-fluorescente. <ul><li> Cubreobjetos se montan en portaobjetos de vidrio con un medio Antifade de montaje, tales como prolongar oro con DAPI. Por otra parte, el etiquetado de Educación y la amplificación puede ser seguido por inmunocitoquímica fluorescentes estándar para etiquetar otros marcadores celulares. </li></ul></li></ol> 4. Los resultados representativos: Visualización de la replicación del ADN mitocondrial como marcador de la biogénesis mitocondrial Estamos interesados ​​en cómo las neuronas sensoriales (Figura 1) regular el número de mitocondrias. Este protocolo etiqueta nueva síntesis de ADN mitocondrial con un marcador fluorescente como una forma de medir la producción de nuevas mitocondrias. La incorporación de la Educación sintética de nucleótidos seguido de la química haga clic en la amplificación de Oregon Green-azida y posterior con el Alexa-Fluor 488 resultados tyramide en el etiquetado de ADN mitocondrial con una señal verde fluorescente (Figura 2). Si se hace correctamente, la señal amplificada verde es lo suficientemente mayor que la fluorescencia de fondo (como la autofluorescencia celular o un efecto secundario de la reacción de HRP-TSA). Esta técnica está diseñada para etiquetar ADNmt recién replicado con el fin de visualizar y cuantificar la biogénesis mitocondrial dentro de los compartimentos subcelulares de las neuronas (Figura 3). El etiquetado permite a Edu para inmunocitoquímica fluorescentes con posterioridad a la etiqueta de otros marcadores celulares como neurofilamentos (Figura 3D). La reacción de la TSA también se puede hacer con otras fluorescentes tyramides Alexa Fluor como Alexa Fluor 594-tyramide. Esto se traduce en una señal fluorescente verde de la reacción nuclear clic Oregon Green-azida en el núcleo, pero no hay ninguna señal verde en el ADNmt, que no se puede detectar antes de la TSA. La amplificación con Alexa Fluor 594-tyramide intensifica la etiqueta nuclear y pone de manifiesto la Educación incorpora en el ADNmt, con una señal roja fluorescente (Figura 4). Un procedimiento de amplificación similar se utiliza para visualizar la incorporación de BrdU en nueva síntesis mitocondrial (Figura 5), ​​sin embargo, este método requiere un paso adicional para recuperar el epítopo BrdU por un ácido fuertes (HCl) o digestión enzimática, lo que no es necesario para Edu etiquetado. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Representante de contraste de interferencia diferencial (DIC) de las imágenes de embriones (izquierda) y adulto (derecha) ganglio de la raíz dorsal (GRD) neuronas que se utilizan normalmente para su análisis. Bares = 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Diagrama esquemático que representa el procedimiento para el etiquetado de Edu en el ADN mitocondrial con una señal verde fluorescente. El esquema representa el protocolo de tres pasos para el etiquetado de Edu en el ADN mitocondrial con una señal verde fluorescente. Actividad mitótica F11 células de neuroblastoma servir como un control positivo y muestran el patrón de etiquetado de Edu, que fue incorporado en el ADN nuclear y mitocondrial. El primer paso (P1) es la incorporación de un análogo de la timidina en el ADN mitocondrial de nueva síntesis mediante la incubación de las células en presencia de Edu. El segundo paso (P2) se basa en la química haga clic en la etiqueta Edu incorporado con una Oregon Green-azida. Señal verde es visible en los núcleos de las células que replican su ADN nuclear. El paso final (P3) es amplificar la Gr Oregoneen-azida señal de incubación con un anticuerpo de conejo conjugado HRP-en contra de Oregon Green seguido de incubación con Alexa Fluor 488 tyramide etiquetado de la presencia de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para visualizar la señal verde en el ADNmt. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Edu etiquetado de ADN mitocondrial en el ganglio de la raíz dorsal (GRD) neuronas. Las neuronas se incubaron con Edu y la señal es posteriormente amplificada para revelar el ADNmt que incorpora Edu. Representante imágenes de fluorescencia superpuestos en la luz transmitida muestra señales de color verde punteada de amplificación Edu (Edu-OG-TSA, verde) incorporada en el ADNmt de nueva síntesis de los dos embriones (A) y adultos (BD), las neuronas DRG. El procedimiento de etiquetado Edu permite posterior tinción de inmunofluorescencia de marcadores neuronales como neurofilamentos (D, αNF, en rojo). Las barras de escala = 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Diagrama esquemático que representa el procedimiento para el etiquetado de Edu en el ADN mitocondrial con una señal fluorescente de color rojo. El esquema representa el protocolo de tres pasos para el etiquetado de Edu en el ADN mitocondrial con una señal fluorescente de color rojo. Actividad mitótica F11 células de neuroblastoma servir como un control positivo y muestran el patrón de etiquetado de Edu, que fue incorporado en el ADN nuclear y mitocondrial. El primer paso (P1) es la incorporación de un análogo de la timidina en el ADN mitocondrial de nueva síntesis mediante la incubación de las células en presencia de Edu. El segundo paso (P2) se basa en la química haga clic en la etiqueta Edu incorporado con una Oregon Green-azida. Señal verde es visible en los núcleos de las células que replican su ADN nuclear. El paso final (P3) es amplificar la Oregon Green-azida señal de incubación con un anticuerpo de conejo conjugado HRP-en contra de Oregon Green seguido de incubación con Alexa Fluor 594 tyramide etiquetado de la presencia de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para visualizar rojo de la señal en el ADNmt. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. BrdU y amplificación de la señal tyramide con una señal fluorescente de color verde o rojo en el ADNmt. El diagrama representa el procedimiento para el etiquetado de BrdU en el ADNmt de nueva síntesis, ya sea con una señal fluorescente de color verde o rojo. Un primer paso es necesario para recuperar el epítopo BrdU por un ácido (HCl) o digestión enzimática, lo que no es necesario para el etiquetado de Edu. El siguiente paso es incubar con un ratón primaria de anticuerpos anti-BrdU. Esto es seguido por incubación con peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado de cabra anti-ratón. Finalmente, la señal se amplifica con un tyramide verde o rojo marcado con fluorescencia en presencia de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para visualizar la señal en el ADNmt.

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Hemos desarrollado un método sensible para la etiqueta del ADNmt de nueva síntesis en las células individuales mediante la amplificación de la señal tyramide de Edu. Uno de los mayores problemas durante la optimización de este protocolo fue la divergencia de resultados entre el cubreobjetos. Se introdujeron cambios en los protocolos de Invitrogen kit para evitar la mezcla de pequeños volúmenes en cubreobjetos individuales y soluciones para la toma principal que se utilizará para todos los cubreobjetos. El l 75-80 mm para cada cubreobjetos de vidrio circular 12 es un volumen ideal para cubrir completamente la superficie mientras que proporciona una solución suficiente para dar resultados consistentes entre las muestras. Los tiempos de incubación y las concentraciones de reactivos se han optimizado, pero la mejora podría ser visto con los ajustes a los mismos. El protocolo está diseñado para ejecutar cada proceso una vez. Sin embargo, algunas de las medidas que se han repetido con nuevas soluciones para recuperar muestras de que no después del primer intento. En particular, los pasos, haga clic Edu reacción (3.4 a 3.6) se han repetido sin un aumento significativo de la fluorescencia de fondo. El anti-Oregon Green-HRP incubación del anticuerpo (4.1 a 4.3) y la amplificación tyramide (4.4-4.5) También se han repetido, pero más a menudo resulta en una mala señal a ruido debido al aumento de la fluorescencia de fondo. Los reactivos más sensibles son los aditivos clic en él Edu Buffer (componente G) y el conejo anti-Oregon Green-HRP de anticuerpos (Componente I) del kit clic en él Edu ensayo de microplacas. El aditivo clic en él Edu Buffer poco a poco se vuelve amarillo con el tiempo si se conserva a 4 ° C y entre 6-12 meses se oscurece considerablemente. Almacenamiento de los aditivos Buffer clic en él Edu a -20 ° C a aliviar este problema. El etiquetado y las medidas tyramide amplificación funcionan mejor cuando el conejo anti-Oregon Green-HRP de anticuerpos se utiliza dentro de 4-6 meses para reconstituir en MilliQ dH 2 O. El etiquetado leve de Edu en el ADNmt permite la comparación directa con otros marcadores celulares 9-11 y aumenta la utilidad de esta técnica sobre otros análogos de la timidina, como el 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), que requiere un trato duro para recuperar su epítopo en el ADN. Nuestro laboratorio de 11-12 y 13-15 a otros han utilizado con éxito para BrdU etiqueta de ADN mitocondrial. La técnica de etiquetado BrdU es similar a la utilizada para la Educación, pero tiene algunas diferencias importantes (figura 5). Después del paso de permeabilización de la lista anterior (3,1 a 3,2), el epítopo BrdU se recupera con un paso de desnaturalización (2 N HCl durante 30 minutos a 37 ° C seguido de tres lavados en PBS 1X). La BrdU es entonces una etiqueta con un anticuerpo primario contra BrdU (Vector Laboratories diluida 1:50 en solución al 1% de bloqueo del equipo de TSA y se incubó durante la noche a 4 ° C). Un paso anticuerpo secundario que se necesita para amplificar la señal de BrdU (cabra anti-IgG de ratón conjugado con HRP de los kits de TSA # 2 y # 5, diluido 1:100 en solución al 1% de bloqueo y se incubó durante 45 min a temperatura ambiente) antes de la los pasos de la TSA (4,3-4,5 por encima). Tener dos análogos de la timidina, Edu y BrdU, con etiqueta de ADNmt es ventajoso para la realización de experimentos de doble etiqueta ADN mitocondrial puede ser secuencial etiquetados en los paradigmas de etiquetado de pulso-11. Nuestro laboratorio está utilizando la UDE y BrdU de ADNmt para examinar la regulación de la biogénesis mitocondrial en el contexto de la neuropatía diabética, una complicación común de diabetes. Hemos utilizado con éxito la amplificación de señal para medir los cambios en el ADN mitocondrial en la biogénesis de las neuronas individuales 11-12. Esta técnica será útil en otros experimentos diseñados para explorar los mecanismos de replicación del ADN mitocondrial y el volumen de negocios o para la identificación de fármacos que inhiben la síntesis de ADN mitocondrial. Además, los principios básicos de amplificar las señales Edu y BrdU se puede aplicar a otros estudios que miden la replicación del ADN o la reparación.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

Las mitocondrias son los principales reguladores de la energía celular y la biogénesis mitocondrial es un componente esencial de la regulación de los números mitocondrias en las células sanas 1-3. Un enfoque para el monitoreo biogénesis mitocondrial es medir el índice de ADN mitocondrial (ADNmt) de replicación 4. Hemos desarrollado una técnica sensible para la etiqueta del ADNmt de nueva síntesis en las células individuales con el fin de estudiar la biogénesis mitocondrial. La técnica combina la incorporación de 5-etinil-2&#39;-desoxiuridina (EDU) 5-7 con una amplificación de la señal tyramide (TSA) 8 protocolo para visualizar la replicación del mtDNA dentro de los compartimentos subcelulares de las neuronas. Edu es superior a otros análogos de la timidina, como el 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), debido a que la reacción inicial haga clic en la etiqueta de Edu 5.7 no requiere que los tratamientos ácidos fuertes o digestión enzimática que se requieren para la exposición del epítopo BrdU . El etiquetado más leve de Educación permite la comparación directa de su incorporación con otros marcadores celulares 90-10. La capacidad de visualizar y cuantificar la biogénesis mitocondrial ofrece una herramienta esencial para la investigación de los mecanismos utilizados para regular la biogénesis mitocondrial y que proporcionar información sobre la patogénesis relacionados con la toxicidad del fármaco, el envejecimiento, el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas. Nuestra técnica es aplicable a las neuronas sensoriales, así como otros tipos de células. El uso de esta técnica para medir la biogénesis mitocondrial tiene importantes implicaciones en la promoción de la comprensión de la fisiología celular normal, así como deterioro de los estados de enfermedad.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Hemos desarrollado una técnica sensible para la etiqueta nueva síntesis de ADN mitocondrial (ADNmt) en las células individuales con el fin de estudiar la biogénesis mitocondrial. La técnica combina la incorporación de la Educación junto con una amplificación de la señal tyramide (TSA) de protocolo para visualizar la replicación del mtDNA dentro de los compartimentos subcelulares de las neuronas.

Visualización de la replicación del ADN mitocondrial en las células individuales de amplificación de la señal Edu

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

visualization-mitochondrial-dna-replication-individual-cells-edu

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K vistas.  University of Michigan. Hemos desarrollado una técnica sensible para la etiqueta nueva síntesis de ADN mitocondrial (ADNmt) en las células individuales con el fin de estudiar la biogénesis mitocondrial. La técnica combina la incorporación de la Educación junto con una amplificación de la señal tyramide (TSA) de protocolo para visualizar la replicación del mtDNA dentro de los compartimentos subcelulares de las neuronas.

Video: Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Reproducción automática de vídeo interactivo de Estudios de la Comunicación Animal

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Investigación

Neurociencias

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types that comprise the BBB; these cells have a very high-energy demand, which requires optimal mitochondrial function. In the case of disease or injury, the mitochondrial function in these cells can be altered, resulting in disease or&#160;the opening of the BBB. In this manuscript, we introduce a method to measure mitochondrial function in CVE cells by using whole, intact cells and a bioanalyzer. A mito-stress assay is used to challenge the cells that have been perturbed, either physically or chemically, and evaluate their bioenergetic function. Additionally, this method also provides a useful way to screen new therapeutics that have direct effects on mitochondrial function. We have optimized the cell density necessary to yield oxygen consumption rates that allow for the calculation of a variety of mitochondrial parameters, including ATP production, maximal respiration, and spare capacity. We also show the sensitivity of the assay by demonstrating that the introduction of the&#160;microRNA, miR-34a, leads to a pronounced and detectable decrease in mitochondrial activity. While the data shown in this paper is optimized for the bEnd.3 cell line, we have also optimized the protocol for primary CVE cells, further suggesting the utility in preclinical and clinical models.

Endothelial cell mitochondria are critical to maintain blood-brain-barrier integrity. We introduce a protocol to measure bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells.

Evaluación de la función bioenergética en las células endoteliales vasculares cerebrales

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Visualización de módulos corticales en cortezas mamíferos aplanados

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.