Agradecemos al Dr. Richard Allison, ex director de la instalación de péptido LSU para la síntesis de ligandos fluorescentes, el Centro de Investigación de Biotecnología Interdisciplinaray, UF para la síntesis del péptido ligando-lítica, y la instalación del microscopio Socolovsky para facilitar el acceso a los microscopios de fluorescencia. El financiamiento fue proporcionado por el Programa de Desarrollo SERDP exploratorio (SEED) del Departamento de Defensa, el Departamento de Energía y la Agencia de Protección Ambiental, el Programa de Biotecnología AgCenter Equipo Interdisciplinario y el estado de Louisiana.

Experimento 1: Extracción de la tripa de termitas protozoos en condiciones anaeróbicas <ol><li> Use una caja del ventilador (Laboratorios Coy) en una caja de guantes para hacer circular constantemente aire a través de un desecante y el tipo D catalizador Stak Paks-para controlar la humedad y los niveles de oxígeno y eliminar temperaturas irregulares. Llene la caja de guantes con un flujo continuo de nitrógeno de 20 a 30 min. Monitorear los niveles de oxígeno con un sensor de oxígeno (C al cuadrado, Inc.) durante 1 h. El uso de nitrógeno para alcanzar y mantener las condiciones anaeróbicas cuando sea necesario. </li><li> Prepare Trager U medios de comunicación (Trager 1934) y ajustar el pH a 7.0. Aspersión del filtro esterilizado en la guantera con una mezcla de 2,5% de hidrógeno, dióxido de carbono al 5% y el 92,5% de nitrógeno durante 1 h para eliminar los restos de oxígeno. </li><li> Silanizar todos los materiales incluyendo el microscopio, tubos de microcentrífuga, pipetas, vasos, etc utilizados en los experimentos con Sigmacote para evitar la adsorción de los protozoos o los péptidos a las superficies (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / mediaLib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf). </li><li> Desde el intestino de termitas protozoos son organismos anaerobios estrictos que no debe ser expuesto al oxígeno. Por lo tanto, los siguientes pasos se llevan a cabo en condiciones anaeróbicas en una caja de guantes (ver 1.1). Con una pinza de sumergir todo el cuerpo de un trabajador de termitas en el 70% de etanol y agite suavemente durante unos 10 s para eliminar los contaminantes de la superficie. </li><li> Retire al trabajador de que el etanol y dejar secar en una Kimwipe limpia durante unos 20 s. Use un recipiente estéril de punta fina pinza para sostener el abdomen de los trabajadores y apoderarse de la punta del abdomen con otro par de pinzas para tirar suavemente el intestino hacia arriba o hacia abajo en un ángulo de 45 grados. Si el intestino se tira en un ángulo recto y con mucha fuerza, es probable que se rompan. Lugar 10 en las tripas una caída de 100 medios de comunicación l Trager U sobre un portaobjetos de microscopio. </li><li> Pierce la tripa con un par de sondas estériles fina disección para liberar a los protozoos y suavemente transferir el contenido de los intestinos con una pipeta 200 l en un tubo de microcentrífuga de 1 ml que contiene 900 l Trager U medios de comunicación. Después de permitir la sedimentación de los fragmentos de la pared intestinal (5 s), la transferencia de 900 l del sobrenadante a un tubo nuevo. </li><li> Transferencia de 10 l de la cultura protozoos a un portaobjetos de microscopio sigmacoted y comprobar el estado de los protozoos al microscopio con un aumento de X 200. </li><li> Preparar cultivos de control de la Tetrahymena pyriformis aeróbico protozoos, amebas sp. Euglena sp. Y sp Paramecium. (Carolina Biological Supply Company, Burlington, Carolina del Norte), así como un cultivo de una noche de Escherichia coli en los medios de cultivo recomendados por el proveedor. </li></ol> Experimento 2: Agregar ligando junto con un colorante fluorescente a los protozoos y las bacterias culturas para la prueba de la unión a la superficie de las membranas y paredes celulares Antes utilizábamos las bibliotecas de fagos (New England Biolabs Inc, Ipswich, MA) para identificar 19 secuencias heptapéptido que se unen a los protozoos (protocolos disponibles en http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). Un ligando con una secuencia de péptidos (ALNLTLH) que mostraba similitudes con las glicoproteínas supuestos conocidos de la membrana del Trypanosoma brucei fue sintetizado y acoplado a una sonda fluorescente C-terminal (Edans, 5 - ((2-aminoetil) amino)-naftaleno-1-sulfónico ácido, λmax = 341 nm, λem = 471 nm) a través de la síntesis de péptidos estado sólido (SSPS), utilizando la resina Edans NovaTag (EMD Biosciences). Aquí demostramos que el ligando se une a los protozoos que fueron aisladas de los intestinos de termitas y otros protozoos de vida libre, pero no a las bacterias. <ol><li> La cultura de la protozoos como se describe en el experimento. 1. Fix protozoos con formol al 10% a 4 ° C durante 12 h. </li><li> Centrifugar la solución de los protozoos (30 xg, 10 min), descartar el sobrenadante y lavar el sedimento que contiene los protozoos fija dos veces en 1 ml Trager U medios de comunicación. Vuelva a suspender el precipitado en 1 ml Trager U medios de comunicación. También, fijar otros protozoos y E. bacterias coli para los controles. </li><li> Incubar los microorganismos fijos durante 1-2 h con una solución de ligando sintetizado junto a la Edans tinte fluorescente (preparada en agua) a una concentración final de 50 mM. El ligando se disuelve mejor en agua que los Trager U medios de comunicación. </li><li> Observar los microorganismos en un microscopio de fluorescencia con un aumento de 400 X en un máximo de absorción a 341 nm y una emisión en la región azul a 471 nm. </li></ol> Experimento 3: Prueba de la actividad protozoacidal del ligando unido a un péptido lítico in vitro (cultivo de protozoos) Un conjugado del ligando y la lítica Hecate péptido (Mutwiri et al. 2000) fue sintetizado anteriormente en el Fondo para la proteína de LSU. <ol><li> Silanizar materiales y preparar cultura termitas protozoos intestinales en la guantera un anaerobios se describe en el experimento. 1. </li><li> Preparar cultivos de microorganismos aerobios de control (por ejemplo, E. coli y pyriformis las especies de vida libre de protozoos T.). </li><li> En el ambiente anaerobio de la caja de guantes, pipetas 6 alícuotas de 198 l de la cultura de los protozoos en 0,5 ml tubos Eppendorf. Añadir 2 l de una solución 100 mM de péptido ligando-lítica de la mitad de las alícuotas (concentración final 1 mM) de la cultura tripa de termitas protozoos. Añadir 2 l de agua a la otra mitad de las alícuotas (controles). </li><li> En el laboratorio, preparar alícuotas similares de E. coli y T. pyriformis con 1 mM de péptido lítico, ligando péptido lítico o el agua. </li><li> Después de 1 h, en 10 l de cada cultura protozoos a las diapositivas. Comparar la supervivencia de los pacientes tratados protozoos a la de los controles con un microscopio con un aumento de X 200. </li><li> Después de 1 h, la placa de 100 l de aprox. 10 -4 dilución de la E. culturas coli en BHI y se incuban a 37 ° C durante la noche. Compare el número de unidades formadoras de colonias en las placas. </li></ol> Experimento 4: Inyección del ligando unido a un tinte fluorescente en el intestino grueso en las termitas <ol><li> Tire las agujas (modelo GD-1, 1 X 900 mm) con un Narishige PC-10 vidrio extractor micropipeta con un nivel de calor de una etapa doble (65 y 48) para obtener un tamaño de la punta de 20-30 micras. Confirmar el tamaño de la punta al medir con un microscopio con un micrómetro. </li><li> Llene una aguja con ca. 30 l de 50 M de ligando marcado con fluorescencia suspendidas en el agua utilizando una jeringa conectada. Llene otra aguja con agua para el control. Adjunte una micropipeta (0,5 l de capacidad y 32 mm de longitud, Drummond Scientific Company) a un titular en un micromanipulador. Coloque una aguja a la titular de sistema de inyección en un micromanipulador segundos. Establezca los parámetros de la inyección inicial de aproximadamente 1 s la duración del impulso y 10-12 psi inyección. Avanzar la aguja lentamente en la micropipeta e inyectar la solución con un pedal impulsados ​​por alta velocidad del sistema de inyección electrónica con una longitud de pulso de control conectado a un flujo de gas nitrógeno controlado, lo que asegura que un volumen constante es reproducible inyectado. Después de la inyección, retirar la micropipeta y registrar la duración de la solución inyectada utilizando un calibrador Vernier. Calcular el volumen inyectado de los parámetros conocidos de la micropipeta. Ajustar la presión de gas nitrógeno y la longitud del pulso para expulsar a 0,3 l solución en una sola inyección. </li><li> Exprima el extremo del abdomen de los trabajadores de termitas con una pinza suave para eliminar las heces presentes en el recto. Inmovilizar a los trabajadores de termitas por el frío en hielo durante 5 min. </li><li> Hacen los receptores para la celebración de las termitas obreras cortando 100 puntas de pipeta l utilizando una hoja de bisturí. Cortar la punta de una longitud de 10 - 12 mm y el uso de acuerdo con el tamaño de las termitas. </li><li> Conecte el receptor a la micromanipulador. Colocar un obrero en una placa de Petri en su lado dorsal y aspirar la cabeza de los trabajadores por primera vez en el receptor con una bomba de succión de nitrógeno de manera que el término de la sobresale de los trabajadores del receptor. </li><li> La celebración de la termita en el receptor, con cuidado avanzar la aguja llena con el micromanipulador para insertarlo en el ano de los trabajadores. Inyectar 0,3 l de la solución (ligando fluorescente marcada o agua para los controles). </li><li> Lugar a los trabajadores inyectado con el ligando o el agua en una cápsula de Petri con papel filtro húmedo y mantenerlos a 26 ± 2 ° C con 78% de HR </li><li> Extirpar las entrañas de las termitas se inyecta y recoger los protozoos después de 24 h como se muestra arriba en el experimento. 1. Fijar y observar los protozoos como se muestra en el experimento. 2. </li></ol> Experimento 5: Pruebas de la actividad protozoacidal del ligando unido a un péptido lítico en vivo (una inyección en las termitas del intestino grueso) <ol><li> Silanizar materiales como se describe en el experimento. 1. </li><li> Prepare una solución de 500 mM del péptido ligando-lítica en el agua. </li><li> Siga los pasos 3.1) a 3.4) para preparar las agujas de vidrio, los receptores y las termitas obreras. </li><li> Siguiendo los métodos descritos en el punto 3.5) se inyecta 0,3 l de solución de péptido ligando-lítico (tratamiento) o agua (control) en el intestino grueso de los 20 trabajadores de termitas. </li><li> Mantenga las termitas durante 24 h, las vísceras extirpar de varios trabajadores y observar el contenido intestinal bajo el microscopio como se describe en 3.6). y 3.7). </li><li> Tan pronto la muerte de los protozoos en el intestino de termitas se confirma, mantener las termitas restantes tratados y los controles en placas de Petri con papel filtro húmedo y observar la mortalidad diaria. </li></ol> Los resultados representativos: Experimento 1: Por lo general, intestino anterior, intestino medio y el intestino posterior se obtienen en una sola pieza cuando el procedimiento se sigue correctamente (Figura 1a). Los protozoos viven en alta densidad en las partes anaeróbica del intestino grueso y puede ser liberado por la perforación del intestino grueso con unas pinzas (Figura 1b 1 y 2). La mayor protoespecies zoa en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa es la P. en forma de huso grassii, que es de 200-300 micras de largo y 150 micras y se puede ver a simple vista. La segunda especie más grande es el H. en forma de pera hartmanni (50 a 140 micras de largo y 30-80 mm). La especie más pequeña es la S. en forma de cono leidyi (15-50 micras de largo y 8.30 m;. Lai et al, 1983). Las especies de protozoos se muestran en la Figura 2. En condiciones óptimas de cultivo de las tres especies de protozoarios aislados en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa se quedará con vida y saludable por lo menos durante 72 horas en los medios de comunicación anaeróbica Trager U (Figura 3a). Sin embargo, si las condiciones de cultivo no son óptimas protozoos va a morir rápidamente. Si hay residuos de oxígeno en los medios de comunicación, el movimiento de los protozoos se ponga fin de inmediato. Si la presión osmótica es muy alta o la integridad de la membrana se ve comprometida la membrana de la superficie de la protuberancia se protozoos a cabo y la ruptura de las células (Figura 3b). Si la presión osmótica es demasiado bajo o en las membranas se ven comprometidos, los protozoos, se secan y se encogen (Figura 3c). Experimento 2: Se confirmó que el ligando acoplado a una sonda fluorescente ligado a las tres especies de protozoos del intestino grueso de las termitas subterráneas de Formosa en la densidad detectable. La unión del ligando se produce en la superficie de células enteras (Figura 4). Sitios de unión se concentran en la región anterior de los protozoos en el axostyle (una hoja de microtúbulos) y el núcleo de P. grassii. Hemos observado algunos autofluorescencia irregular de partículas de madera ingeridos por los protozoos. Sin embargo, la autofluorescencia es generalmente fácil de discernir a partir de la unión específica del ligando, ya que no hay autofluorescencia de la superficie, axostyle y el núcleo (Figura 4). También se detectó la fluorescencia en todas las bandas de especies de vida libre aeróbica protozoos (Figura 5), ​​lo que sugiere que el ligando se une a las estructuras genéricas de los protozoos. Sin embargo, no se observó la unión del ligando de E. coli. Experimento 3: Una M de ligando-lítica péptido murieron las tres especies de protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa los trabajadores y de la T. de vida libre pyriformis in vitro en menos de 10 minutos, mientras que los controles se mantuvo con vida. La Figura 6 muestra la pérdida progresiva de la integridad de la membrana de los intestinos de termitas protozoos tratados con péptido ligando-lítico. Membranas de bombeo y de la ruptura, se marchitan y mueren los protozoos. No se observaron diferencias en el número de E. colonias coli entre los tratamientos de ligando-lítica de péptidos y el agua. Péptido lítico sin ligando, sin embargo, redujo el número de E. colonias coli considerablemente (Figura 7). Esto sugiere que la unión del ligando en cierta medida protege los microorganismos no objetivo de la lisis. Experimento 4: Cuando 0,3 l 50 M del ligando marcado con fluorescencia se inyecta en el intestino grueso de los trabajadores de las termitas, la unión a P. grassii, S. leidyi y H. hartmanni fue confirmado a través de microscopía de fluorescencia similar a Exp. 2 (Figura 4). Tejido intestinal termitas no mostraron fluorescencia. Experimento 5: La inyección de 0,3 l 500 M péptido ligando-lítica murieron las tres especies de protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa dentro de 24 horas. Las termitas murió dentro de 10 días después de la pérdida de su protozoos simbióticos. Anteriormente, Husseneder y Collier (2009) inyectaron la misma concentración de péptido lítico en las entrañas de termitas. Sin el ligando unido, que tomó más tiempo hasta que los protozoos en el intestino (72 h) y las termitas estaban muertos (seis semanas). Esto sugiere que el ligando aumenta la eficiencia de péptidos protozoacidal lítico, lo más probable por la unión de los péptidos líticos de los protozoos. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. a: Formosa intestino de termitas subterráneas en una diapositiva que muestra las principales secciones del intestino (delanteras, mediados de intestino grueso), b 1 y 2: intestino posterior se perfora con una pinza para liberar el contenido intestinal que contiene los protozoos. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Las tres especies de protozoos flagelados en el intestino grueso de las termitas subterráneas de Formosa: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni, y c) leidyi Spirotrichonympha. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Protozoos en la cultura, un sano) protozoos, b) Los protozoos con membranas protuberantes, c) arrugadas protozoos. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La confirmación de la unión del ligando acoplado a una sonda fluorescente a las termitas del intestinoprotozoos (de arriba a abajo: P. grassii, H. hartmanni, S. leydi), tratados con el ligando fluorescente marcado y los controles no tratados (mostrando autofluorescencia). <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Unión del ligando a protozoos de vida libre aeróbica, a) Tetrahymena, b) la ameba, c) Euglena y Paramecium d). <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. El tratamiento de los protozoos con agua) (control) y b) un ligando M-lítica de péptidos. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. E. colonias coli en las placas (10 dilución -4): a) se trata con agua (control), b) tratados con 1 mM de péptido ligando-lítica, c) tratados con una M péptido lítico.

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	<li>Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugates+of+lytic+peptides+and+LHRH+or+&#946;CG+target+and+cause+necrosis+of+prostate+cancers+and+metastases.">Conjugates of lytic peptides and LHRH or &#946;CG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).</li><li>Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paratransgenesis+for+termite+control.">Paratransgenesis for termite control.</a> Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically+engineered+bacteria+(Escherichia+coli)+to+monitor+ingestion,+loss+and+transfer+of+bacteria+in+termites.">Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites.</a> Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+termite+gut+bacteria+deliver+and+spread+foreign+genes+in+termite+colonies.">Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).</li><li>Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+antimicrobial+peptides+with+low+mammalian+cell+toxicity.">De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity.</a> J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).</li><li>Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+and+distribution+of+the+three+species+of+symbiotic+protozoa+in+the+hindgut+of+Coptotermes+formosanus+(Isoptera).">Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera).</a> Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).</li><li>Leuschner, C., Hansel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+disrupting+lytic+peptides+for+cancer+treatments.">Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments.</a> Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).</li><li>Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+Antimicrobial+Peptide,+d-Hecate,+on+Trichomonads.">Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads.</a> J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).</li><li>Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+a+cellulose-digesting+flagellate,+Trichomonas+termopsidis,+and+of+certain+other+termite+protozoa.">The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa.</a> Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).</li></ol>

Ligando-lítica péptidos se han utilizado con éxito para hacer frente eficazmente y destruir las células cancerosas (Hansel y Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Basado en este concepto, hemos desarrollado un ligando heptapéptido que se une a la superficie de los protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa y junto a un péptido lítico con el objetivo de destruir estos obligan digerir la celulosa-simbiontes en el intestino de las termitas para conseguir termitas control (Husseneder y...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>SL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDANS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novabiochem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anaerobic glove box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coy Laboratories, Inc.</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intellus environmental controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Percival</td>
<td>I36NL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PC-10 Glass micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>PC-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>GD-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leitz micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vermont Optechs, Inc.</td>
<td>ACS01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research, Inc.</td>
<td>MINJ-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcaps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>1-000-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA fluorescence imaging system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMRxA2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMLB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>SZ61</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

testing protozoacidal activity of ligand-lytic peptides against termite gut protozoa in vitro (protozoa culture) and in vivo (microinjection into termite hindgut)

Estamos desarrollando un nuevo enfoque para el control de termitas subterráneas que conducirían a una menor dependencia del uso de pesticidas químicos. Las termitas subterráneas son dependientes de los protozoos en el hindguts de los trabajadores para digerir eficientemente la madera. Péptidos líticos se ha demostrado que matar a una variedad de parásitos protozoarios (Mutwiri et al. 2000) y protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa, Coptotermes formosanus (Husseneder y Collier 2009). Péptidos líticos son parte del sistema inmunológico inespecífico de los eucariotas, y destruir las membranas de los microorganismos (Leuschner y Hansel, 2004). La mayoría de los péptidos líticos no pueden perjudicar a los eucariotas superiores, porque no afectan a la eléctricamente neutros que contienen colesterol de las membranas celulares eucariotas superiores (Javadpour et al. 1996). La acción de péptidos líticos pueden ser dirigidos a tipos específicos de células mediante la adición de un ligando. Por ejemplo, Hansel et al. (2007) informó que los péptidos líticos conjugado con ligandos celulares de cáncer receptor de membrana podría usarse para destruir las células de cáncer de mama, mientras que los péptidos líticos solos o conjugados con los no-péptidos específicos no fueron efectivos. Péptidos líticos también se han conjugado con las hormonas humanas que se unen a los receptores en las células tumorales para la destrucción selectiva de la próstata y las células de cáncer de testículo (Leuschner y Hansel, 2004). En este artículo se presentan las técnicas utilizadas para demostrar la actividad protozoacidal de un péptido lítico (Hécate), junto a un ligando heptapéptido que se une a la membrana de la superficie de los protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa. Estas técnicas incluyen la extirpación del intestino de las termitas obreras, la cultura anaeróbica de los intestinos protozoos (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), confirmación microscópica que el ligando marcado con un tinte fluorescente se une al intestino de termitas protozoos y otros protozoos de vida libre, pero no a las bacterias o tejido intestinal. También demuestran que el mismo ligando unido a un péptido lítico eficiente mata termitas protozoos intestinales in vitro (cultivo de protozoos) e in vivo (microinyección en el intestino posterior de los trabajadores), pero es menos bactericida que el péptido lítico solo. La pérdida de protozoos lleva a la muerte de las termitas en menos de dos semanas. En el futuro, que será genéticamente ingeniero de microorganismos que pueden sobrevivir en el intestino de termitas y la difusión a través de una colonia de termitas como &quot;Caballos de Troya&quot; para expresar ligando-lítica péptidos que matar a los protozoos en el intestino de termitas y posteriormente matar a las termitas en la colonia . Ligando-lítica péptidos también podrían ser útiles para el desarrollo de medicamentos contra los parásitos protozoarios.

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Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Se presentan los procedimientos para demostrar que los ligandos se unen a la membrana de la superficie de la celulosa para digerir estos protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa utilizando microscopía de fluorescencia y los ligandos que, junto con los péptidos líticos matar protozoarios<em&gt; In vitro</em&gt; (Cultivo de anaerobios protozoos) y<em&gt; In vivo</em&gt; (Inyección en el intestino grueso de termitas).

Prueba de Actividad Protozoacidal de ligando-lítica péptidos intestinales contra termitas protozoos In vitro (Cultura protozoos) y In vivo (Microinyección en termitas intestino grueso)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

testing-protozoacidal-activity-ligand-lytic-peptides-against-termite

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

14.8K vistas.  Louisiana State University Agricultural Center. Se presentan los procedimientos para demostrar que los ligandos se unen a la membrana de la superficie de la celulosa para digerir estos protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa utilizando microscopía de fluorescencia y los ligandos que, junto con los péptidos líticos matar protozoarios In vitro (Cultivo de anaerobios protozoos) y In vivo (Inyección en el intestino grueso de termitas).

Video: Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

Extracción de ADN de los microbios del intestino de las termitas (Zootermopsis Angusticollis) y visualizar microbios intestinales

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Investigación

Biología

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

La investigación de la comunidad microbiana en el intestino de termitas - Entrevista

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Capas de Simbiosis - Visualización del intestino posterior, las termitas de la comunidad microbiana

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Prueba de las barreras fisiológicas a la transmisión del virus en los áfidos con microinyección

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs are distinguished by a polyhedral lattice of clathrin that coats the vesicle membrane and serves as a mechanical scaffold. Clathrin coats are assembled during vesicle formation from individual clathrin triskelia , the soluble form of clathrin composed of three heavy and three light chain subunits7,8. Because the triskelion does not have the ability to bind to the membrane directly, clathrin-binding adaptors are critical to link the forming clathrin lattice to the membrane through association with lipids and/or membrane proteins9. Adaptors also package transmembrane protein cargo, such as receptors, and can interact with each other and with other components of the CCV formation machinery9.
Over twenty clathrin adaptors have been described, several are involved in clathrin mediated endocytosis and others localize to the trans Golgi network or endosomes9. With the exception of HIP1R (yeast Sla2p), all known clathrin adaptors bind to the N-terminal -propeller domain of the clathrin heavy chain9. Clathrin adaptors are modular proteins consisting of folded domains connected by unstructured flexible linkers. Within these linker regions, short binding motifs mediate interactions with the clathrin N-terminal domain or other components of the vesicle formation machinery9. Two distinct clathrin-binding motifs have been defined: the clathrin-box and the W-box9. The consensus clathrin-box sequence was originally defined as L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10 but variants have been subsequently discovered11. The W-box conforms to the sequence PWxxW (where x is any residue).
Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) was originally identified as an actin associated protein and is necessary for normal actin cytoskeleton structure and dynamics at endocytic sites in yeast cells12. Sla1p also binds the NPFxD endocytic sorting signal and is critical for endocytosis of cargo bearing the NPFxD signal13,14. More recently, Sla1p was demonstrated to bind clathrin through a motif similar to the clathrin box, LLDLQ, termed a variant clathrin-box (vCB), and to function as an endocytic clathrin adaptor15. In addition, Sla1p has become a widely used marker for the endocytic coat in live cell fluorescence microscopy studies16. Here we use Sla1p as a model to describe approaches for adaptor-clathrin interaction studies. We focus on live cell fluorescence microscopy, GST-pull down, and co-immunoprecipitation methods.

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-mediated endocytosis depends on adaptor proteins that coordinate cargo selection and clathrin coat assembly. Here we describe procedures to study adaptor-clathrin physical interaction and live cell imaging approaches using as a model the yeast endocytic adaptor protein Sla1p.

In vivo e in vitro de adaptador de clatrina-Interacción

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

La disección de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest para<em&gt; In vitro</em&gt; Explante cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trasplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

La estimulación de citoplasmáticos de ADN Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

En Vivo microinyección y electroporación del mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...