Wir danken Dr. Allison Richard, ehemaliger Direktor des LSU-Peptid-Anlage für das fluoreszierende Liganden Synthese, die Interdisciplinaray Center for Biotechnology Research, UF für den Liganden-lytische Peptid-Synthese und die Socolovsky Mikroskop-Anlage für den Zugang zur Fluoreszenz-Mikroskopen. Die Finanzierung wurde durch die SERDP Exploratory Development Program (SEED) des Department of Defense, Department of Energy and Environmental Protection Agency, der Biotechnologie AgCenter Interdisziplinäres Team Programm und den Bundesstaat Louisiana zur Verfügung gestellt.

Versuch 1: Extraktion von Termitendarm unter anaeroben Bedingungen Protozoen <ol><li> Verwenden Sie ein Fan-Box (Coy Laboratories) in einer Glove-Box ständig zirkulieren Luft durch ein Trockenmittel und Typ D Katalysator Stak-Paks gegen Feuchtigkeit und Sauerstoff zu kontrollieren und zu beseitigen unebene Temperaturen. Füllen Sie das Handschuhfach mit einem kontinuierlichen Strom von Stickstoff für 20 bis 30 min. Monitor-Sauerstoff mit einem Sauerstoff-Sensor (C-squared, Inc.) für 1 h Verwenden Sie Stickstoff zu erreichen und aufrechtzuerhalten anaeroben Bedingungen, wenn nötig. </li><li> Bereiten Trager U-Medien (Trager 1934) und pH-Wert auf 7,0. Sparge den Filter sterilisiert Medien im Handschuhfach mit einer Mischung von 2,5% Wasserstoff, 5% Kohlendioxid und 92,5% Stickstoff 1 h Sauerstoff zu entfernen. </li><li> Silanisieren allen Materialien einschließlich Objektträger, Mikrozentrifugenröhrchen, Pipetten, Gläser etc. in den Versuchen mit Sigmacote verwendet werden, um die Adsorption von Protozoen zu verhindern oder Peptide auf Oberflächen (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / mediaLib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf). </li><li> Da Termitendarm Protozoen strikt anaeroben Organismen sind, müssen sie nicht dem Sauerstoff ausgesetzt werden. Deshalb sind die folgenden Schritte unter anaeroben Bedingungen in einer Glove-Box (siehe 1.1) durchgeführt. Mit einer Pinzette tauchen den ganzen Körper eine Termite Arbeiter in 70% Ethanol und schwenken Sie für ca. 10 s auf Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Arbeiter aus dem Ethanol und lassen auf eine saubere Kimwipe für etwa 20 s. trocken Verwenden Sie eine sterile spitzen Pinzette an den Arbeitnehmer Bauch halten und sichern Sie sich die Spitze des Bauches mit einem anderen Paar Pinzette vorsichtig den Darm nach oben oder unten in einem Winkel von 45 Grad. Wenn der Darm an einer geraden Winkel und mit zu viel Kraft gezogen wird, ist es wahrscheinlich, auseinander zu brechen. Platz 10 guts in einem Tropfen von 100 ul Trager U Medien auf einen Objektträger. </li><li> Pierce den Mumm mit einem Paar sterile feinen Sezieren Sonden zur Freigabe der Protozoen und sanft Übertragung der Darminhalt mit 200 ul Pipette in ein 1 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 ul Trager U-Medien. Nach Berücksichtigung der Sedimentation Darmwand Fragmente (5 s), Transfer 900 ul des Überstandes in ein frisches Röhrchen. </li><li> Transfer 10 ul der Protozoen Kultur zu einer sigmacoted Objektträger und den Zustand der unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung Protozoen. </li><li> Bereiten Kontroll-Kulturen der aeroben Protozoen Tetrahymena pyriformis, Amoeba sp., Euglena sp. Und Paramecium sp. (Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC) sowie einer Übernachtkultur von Escherichia coli in den Kulturmedien durch den Lieferanten zu empfehlen. </li></ol> Experiment 2: Add-Liganden mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt die Protozoen und die Bakterienkulturen zur Bindung an die Oberfläche Membranen und Zellwände Test Wir haben bereits Phagen-Display-Bibliotheken (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA) verwendet zu 19 Heptapeptid-Sequenzen, die Protozoen (Protokolle zur Verfügung zu http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf) binden zu identifizieren. Ein Ligand mit einer Peptidsequenz (ALNLTLH), die Ähnlichkeiten mit vermeintlichen Glykoproteine ​​aus der Trypanosoma brucei Membran bekannt zeigte, wurde synthetisiert und gekoppelt mit einem C-terminalen fluoreszierende Sonde (EDANS, 5 - ((2-Aminoethyl) amino) naphthalin-1-sulfonsäure Säure, lmax = 341 nm, λem = 471 nm) über Solid-State-Peptid-Synthese (SSP) mit der EDANS NovaTag Harz (EMD Biosciences). Hier zeigen wir, dass der Ligand an den Protozoen, die aus der Termitendarm und andere frei lebende Protozoen, aber nicht die Bakterien isoliert wurden, bindet. <ol><li> Kultur der Protozoen wie in Exp. 1. Fix Protozoen mit 10% Formaldehyd bei 4 ° C für 12 h </li><li> Centrifuge die Protozoen-Lösung (30 xg, 10 min), den Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit den festen zweimal in 1 ml Trager U Medien Protozoen. Re-suspend das Pellet in 1 ml Trager U-Medien. Auch fix andere Protozoen, und E. coli-Bakterien für die Kontrollen. </li><li> Inkubieren der festen Mikroorganismen für 1-2 h mit einer Lösung von synthetisierten Liganden gekoppelt an den Fluoreszenzfarbstoff EDANS (hergestellt in Wasser) in einer Endkonzentration von 50 uM. Der Ligand löst in Wasser besser als Trager U-Medien. </li><li> Beachten Sie die Mikroorganismen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 400-facher Vergrößerung bei einem Absorptionsmaximum bei 341 nm und einer Emission im blauen Bereich bei 471 nm. </li></ol> Versuch 3: Testen protozoacidal Aktivität des Liganden gekoppelt an eine lytische Peptid in vitro (Protozoen Kultur) Ein Konjugat des Liganden und die lytische Peptid Hecate (Mutwiri et al. 2000) war zuvor bei der LSU Protein-Fazilität synthetisiert. <ol><li> Silanisieren Materialien und bereiten Termitendarm Protozoen Kultur in der anaeroben Handschuh Box eins beschrieben in Exp. 1. </li><li> Bereiten Kulturen der aeroben Bekämpfung von Mikroorganismen (zB E. coli und die frei lebenden Einzeller Arten T. pyriformis). </li><li> In der anaeroben Umgebung des Handschuhfachs, Pipette 6 Aliquots von 198 ul von Protozoen Kultur in 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Add 2 ul einer 100 uM Lösung von Ligand-lytische Peptid auf die Hälfte der Aliquots (Endkonzentration 1 M) der Termitendarm Protozoen Kultur. Add 2 l Wasser, die andere Hälfte der Aliquots (Kontrollen). </li><li> Auf dem Labortisch, bereiten ähnliche Aliquots von E. coli und T. pyriformis mit 1 uM lytische Peptid-Ligand-lytische Peptid oder Wasser. </li><li> Nach 1 h Transfer 10 ul jeder Protozoen Kultur, um die Folien. Vergleichen Sie die Überlebensrate der behandelten Protozoen auf, dass der Kontrollen unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung. </li><li> Nach 1 h, Platte 100 ul von rd. 10 -4 Verdünnung der E. coli Kulturen auf BHI und bei 37 ° C über Nacht. Vergleichen Sie die Zahlen der koloniebildenden Einheiten auf den Tellern. </li></ol> Experiment 4: Die Injektion des Liganden gekoppelt mit einem fluoreszierenden Farbstoff in in der Termite Enddarm <ol><li> Pull Nadeln (Model GD-1, 1 X 900 mm) mit einem Narishige PC-10 Glasmikropipette Abzieher mit einem zweistufigen Wärme-Ebene (65 und 48) eine Spitze Größe von 20-30 &amp;mgr; m zu erhalten. Bestätigen Sie die Größe der Spitze durch die Messung unter dem Mikroskop mit einem Mikrometer. </li><li> Füllen Sie eine Nadel mit ca. 30 ul 50 uM von fluoreszenzmarkierten Liganden suspendiert in Wasser mit einer angehängten Spritze. Füllen Sie eine andere Nadel mit Wasser für das Steuerelement. Befestigen einer Mikropipette (0,5 ul Kapazität und 32 mm Länge, Drummond Scientific Company) mit einer Halterung in einem Mikromanipulator. Bringen Sie eine Nadel, um das Einspritzsystem Halter in einem zweiten Mikromanipulator. Set ersten Injektion Parameter auf ca. 1 s Impulsdauer und 10-12 psi Injektion. Schieben Sie die Nadel langsam in die Mikropipette und injizieren Sie die Lösung mit einem Pedal-angetriebenen Hochgeschwindigkeits-elektronisches Einspritzsystem mit einer Pulslänge Kontrolle angebracht, um eine kontrollierte Stickstoffgasstrom, was bedeutet, dass ein konstantes Volumen reproduzierbar injiziert wird gewährleistet. Nach der Injektion, entfernen Sie die Mikropipette und notieren Sie die Länge der injizierten Lösung mit einem Messschieber. Berechnen Sie das injizierte Volumen aus den bekannten Parametern der Mikropipette. Passen Sie den Druck von Stickstoffgas und die Pulslänge bis 0,3 ul-Lösung in einer einzigen Injektion zu vertreiben. </li><li> Squeeze Ende einer Termite Arbeiter Bauch mit weichen Pinzette keine Ausscheidungen in den Enddarm zu entfernen. Immobilisieren Termite Arbeiter durch Kühlen auf Eis für 5 min. </li><li> Machen Empfängern zur Aufnahme von Termiten Arbeiter durch Abschneiden 100 ul Pipettenspitzen mit einem Skalpell. Schneiden Sie die Spitze auf eine Länge von 10 bis 12 mm und verwenden Sie je nach Größe der Termiten. </li><li> Befestigen Sie den Empfänger an den Mikromanipulator. Einen Arbeiter auf einer Petrischale auf seiner dorsalen Seite und saugen den Arbeiter mit dem Kopf voran in den Hörer mit einem Stickstoff-Saugpumpe, so dass die Endstation der Arbeiter ragt aus dem Empfänger. </li><li> Halten Sie die Termiten in den Empfänger sorgfältig Voraus gefüllt Nadel mit dem Mikromanipulator, um es in Arbeiter Anus einzufügen. Inject 0,3 ul der Lösung (fluoreszenzmarkierten Liganden oder Wasser für Kontrollen). </li><li> Legen Sie die Arbeiter mit Liganden oder Wasser in separate Petrischalen injiziert mit feuchtem Filterpapier und halten sie bei 26 ± 2 ° C mit 78% RH </li><li> Auszurotten Mumm von der injizierten Termiten und sammeln die Protozoen nach 24 h, wie oben gezeigt in Exp. 1. Fix und beobachten Sie die Protozoen wie in Exp gezeigt. 2. </li></ol> Experiment 5: Testen protozoacidal Aktivität des Liganden gekoppelt an eine lytische Peptid in vivo (Injektion in Termiten Enddarm) <ol><li> Silanisieren Materialien wie in Exp. 1. </li><li> Bereiten Sie eine 500 uM Lösung des Liganden-lytische Peptid in Wasser. </li><li> Führen Sie die Schritte 3,1) durch 3,4) auf Glas Nadeln, Empfänger und Termiten Arbeiter vorzubereiten. </li><li> Nach dem Verfahren in 3.5 beschrieben) injizieren 0,3 ul der Ligand-lytische Peptid-Lösung (Behandlung) oder Wasser (Kontrolle) in den Enddarm von 20 Termite Arbeiter. </li><li> Halten Termiten für 24 h, auszurotten guts von mehreren Arbeitnehmern und beobachten Darminhalt unter dem Mikroskop wie in 3.6 beschrieben). und 3,7). </li><li> Sobald ein Tod in der Termitendarm Protozoen bestätigt wird, halten verbleibenden behandelten Termiten und steuert in Petrischalen mit feuchtem Filterpapier und beobachten Sterblichkeit täglich. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Experiment 1: In der Regel Vorderdarm, Mitteldarm und Enddarm sind in einem Stück erhalten, wenn das Verfahren korrekt ist (Abbildung 1a) gefolgt. Die Protozoen wohnen in hoher Dichte in der anaeroben Teile der Enddarm und kann durch Einstechen in die Enddarm mit einer Pinzette (Abbildung 1b 1 &amp; 2) freigesetzt werden. Die größte protozoa Arten im Darm von der Formosa unterirdischen Termite ist der spindelförmige P. grassii, die 200-300 mu m lang und 150 &amp;mgr; m breit ist und mit dem bloßen Auge gesehen werden. Die zweitgrößte Arten ist die birnenförmige H. hartmanni (50 bis 140 mu m lang und 30-80 &amp;mgr; m breit). Die kleinste Art ist das kegelförmige S. leidyi (15-50 &amp;mgr; m lang und 8-30 &amp;mgr; m breit;. Lai et al 1983). Die Protozoen Arten sind in Abbildung 2 dargestellt. Unter optimalen Kulturbedingungen die drei Arten von Protozoen aus dem Darm von Termiten Formosan unterirdischen isoliert bleiben lebendig und gesund für mindestens 72 h in anaeroben Trager U-Medien (Abbildung 3a). Allerdings, wenn Kultur nicht optimal sind Protozoen schnell sterben. Wenn es Sauerstoff Rückstände in den Medien sind, wird die Bewegung der Protozoen sofort einzustellen. Wenn osmotische Druck ist zu hoch oder Membranintegrität der Oberfläche Membran der Protozoen wird wölben und die Zellen Bruch (Abb. 3b) gefährdet ist. Wenn osmotische Druck ist zu niedrig oder Membranen sind gefährdet, wird Protozoen schrumpfen und schrumpfen (Abbildung 3c). Experiment 2: Wir haben bestätigt, dass der Ligand an eine fluoreszierende Sonde gebunden, alle drei Arten von aus dem Enddarm von Formosa unterirdischen Termiten in nachweisbaren Dichten Protozoen gekoppelt. Ligandenbindung erfolgt auf der gesamten Zelloberfläche (Abbildung 4). Bindungsstellen sind im vorderen Bereich des auf der axostyle (ein Blatt von Mikrotubuli) und Kern in P. Protozoen konzentriert grassii. Wir beobachteten einige lückenhaft Autofluoreszenz von Holzspänen durch die Protozoen aufgenommen. Allerdings ist Autofluoreszenz in der Regel leicht von spezifischen Bindung des Liganden zu erkennen, da es keine Autofluoreszenz der Oberfläche, die axostyle und den Zellkern (Abbildung 4). Wir haben auch erkannt Fluoreszenz in allen getesteten frei lebenden aeroben Protozoen Spezies (Abbildung 5), was bedeutet, dass der Ligand Strukturen allgemein, um Protozoen bindet schlägt. Es wurde jedoch kein Ligandenbindung für E. beobachtet coli. Versuch 3: Ein uM von Ligand-lytische Peptid tötete alle drei Arten von aus dem Darm von Formosa unterirdischen Termite Arbeitnehmer und der frei lebenden T. Protozoen pyriformis in vitro in weniger als 10 min, während Kontrollen am Leben geblieben. Abbildung 6 zeigt den fortschreitenden Verlust der Membran-Integrität der Termitendarm Protozoen behandelt mit Ligand-lytische Peptid. Membranen Ausbuchtung und Bruch, Protozoen schrumpfen und sterben. Es wurde kein Unterschied in der Anzahl der E. beobachtet coli-Kolonien zwischen den Behandlungen von Ligand-lytische Peptid und Wasser. Lytische Peptid ohne Ligand, aber die Zahl der E. coli-Kolonien erheblich (Abbildung 7). Dies deutet darauf hin, dass die Bindung des Liganden zu einem gewissen Grad schützt nicht Zielmikroorganismen von Lyse. Experiment 4: Wenn 0,3 ul 50 uM der fluoreszenzmarkierten Liganden in den Enddarm von Termiten Arbeiter injiziert wurde, die Bindung an P. grassii, S. leidyi und H. hartmanni wurde über Fluoreszenzmikroskopie ähnlich Exp bestätigt. 2 (Abbildung 4). Termite Darmgewebe nicht fluoreszieren. Experiment 5: Injektion von 0,3 ul 500 uM Ligand-lytische Peptid tötete alle drei Arten von im Darm von Termiten Formosan unterirdischen innerhalb von 24h Protozoen. Termiten starben innerhalb von 10 Tagen nach Verlust ihrer symbiotischen Protozoen. Zuvor injiziert Husseneder und Collier (2009) die gleiche Konzentration an lytische Peptid in Termiten Mut. Ohne den beigefügten Liganden, dauerte es mehr Zeit, bis die in den Darm (72 h) Protozoen und die Termiten tot waren (sechs Wochen). Dies deutet darauf hin, dass der Ligand protozoacidal Effizienz der lytische Peptide, wahrscheinlich durch die Bindung des lytischen Peptiden an der Protozoen erhöht. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. a: Formosan unterirdischen Termitendarm auf einer Folie, die die wichtigsten Abschnitte des Darms (Vorder-, Mittel-, Enddarm); b 1 &amp; 2: Enddarm ist mit einer Pinzette durchbohrte den Darminhalt mit den Protozoen freizugeben. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die drei Arten von Flagellaten Protozoen im Enddarm der Formosa-Termite unterirdischen gefunden: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni und c) Spirotrichonympha leidyi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Protozoen in Kultur, Protozoen a) Gesunde, b) Protozoen mit prall gefüllten Membranen, c) vertrocknet Protozoen. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Bestätigung der Bindung des Liganden an einen fluoreszierenden Sonde gut Termiten gekoppeltProtozoen (von oben nach unten: P. grassii, H. hartmanni, S. Leydi), behandelt mit fluoreszenzmarkierten Liganden und unbehandelten Kontrollen (Es werden Autofluoreszenz). <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Ligandenbindung an frei lebenden aeroben Protozoen, a) Tetrahymena, b) Amoeba, c) Euglena, und d) Paramecium. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Die Behandlung der mit a) Wasser (Kontrolle) und b) 1 nM Ligand-lytische Peptid Protozoen. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. E. coli-Kolonien auf den Platten (10 -4 Verdünnung): a) mit Wasser (Kontrolle), b) behandelt Behandelt mit 1 uM Ligand-lytische Peptid, c) Behandelt mit 1 uM lytische Peptid.

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	<li>Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugates+of+lytic+peptides+and+LHRH+or+&#946;CG+target+and+cause+necrosis+of+prostate+cancers+and+metastases.">Conjugates of lytic peptides and LHRH or &#946;CG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).</li><li>Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paratransgenesis+for+termite+control.">Paratransgenesis for termite control.</a> Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically+engineered+bacteria+(Escherichia+coli)+to+monitor+ingestion,+loss+and+transfer+of+bacteria+in+termites.">Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites.</a> Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+termite+gut+bacteria+deliver+and+spread+foreign+genes+in+termite+colonies.">Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).</li><li>Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+antimicrobial+peptides+with+low+mammalian+cell+toxicity.">De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity.</a> J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).</li><li>Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+and+distribution+of+the+three+species+of+symbiotic+protozoa+in+the+hindgut+of+Coptotermes+formosanus+(Isoptera).">Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera).</a> Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).</li><li>Leuschner, C., Hansel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+disrupting+lytic+peptides+for+cancer+treatments.">Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments.</a> Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).</li><li>Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+Antimicrobial+Peptide,+d-Hecate,+on+Trichomonads.">Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads.</a> J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).</li><li>Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+a+cellulose-digesting+flagellate,+Trichomonas+termopsidis,+and+of+certain+other+termite+protozoa.">The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa.</a> Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).</li></ol>

Ligand-lytische Peptide wurden erfolgreich verwendet, um effektiv anzugreifen und zu zerstören Krebszellen (Hänsel und Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Basierend auf diesem Konzept entwickelten wir ein Heptapeptid Liganden, der an der Oberfläche bindet Protozoen im Darm von Formosa unterirdischen Termiten und gekoppelt an einen lytische Peptid mit dem Ziel, diese zu verpflichten Zellulose-Verdauung Symbionten im Darm von Termiten zu zerstören, um Termiten zu erreichen Steuerung (Husseneder und Collier 2...

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<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>SL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>EDANS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novabiochem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anaerobic glove box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coy Laboratories, Inc.</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intellus environmental controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Percival</td>
<td>I36NL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PC-10 Glass micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>PC-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>GD-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leitz micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vermont Optechs, Inc.</td>
<td>ACS01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research, Inc.</td>
<td>MINJ-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcaps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>1-000-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA fluorescence imaging system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMRxA2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMLB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>SZ61</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
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testing protozoacidal activity of ligand-lytic peptides against termite gut protozoa in vitro (protozoa culture) and in vivo (microinjection into termite hindgut)

Wir entwickeln einen neuartigen Ansatz zur unterirdischen Termiten, die zu verringerten Vertrauen auf den Einsatz von chemischen Pflanzenschutzmitteln führen würde. Subterranean Termiten sind abhängig von Protozoen in der hindguts der Arbeitnehmer auf effizient verdauen Holz. Lytische Peptide haben gezeigt, dass eine Vielzahl von einzellige Parasiten (Mutwiri et al. 2000) zu töten, und auch im Darm von der Formosa unterirdischen Termite, Coptotermes formosanus (Husseneder und Collier 2009) Protozoen. Lytische Peptide sind Teil des unspezifischen Immunsystems von Eukaryoten, und zerstören die Membranen von Mikroorganismen (Leuschner und Hänsel 2004). Die meisten lytische Peptide sind nicht geeignet, höheren Eukaryonten schaden, weil sie keinen Einfluss auf die elektrisch neutralen Cholesterin-haltigen Zellmembranen von höheren Eukaryonten (Javadpour et al. 1996). Lytische Peptid Aktion kann auf bestimmte Zelltypen durch die Zugabe eines Liganden ausgerichtet sein. Zum Beispiel berichtete Hansel et al. (2007), dass lytischen Peptiden konjugiert mit Krebs Zellmembran-Rezeptor-Liganden verwendet werden könnten, um Brustkrebszellen zerstört werden, während lytische Peptide allein oder konjugiert mit nicht-spezifische Peptide wurden nicht wirksam. Lytische Peptide wurden auch konjugiert menschlichen Hormonen, die an Rezeptoren binden auf Tumorzellen für die gezielte Zerstörung von Prostata-und Hodenkrebs-Zellen (Leuschner und Hänsel 2004). In diesem Artikel präsentieren wir Techniken verwendet, um die protozoacidal Aktivität eines lytischen Peptids (Hecate) gekoppelt an ein Heptapeptid Liganden, der an der Oberfläche der Membran aus dem Darm der Formosa-Termite unterirdischen Protozoen bindet demonstrieren. Diese Techniken umfassen Ausrottung der Darm von Termiten Arbeiter, Protozoen anaerobe Kultur des Darms (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), mikroskopische Bestätigung, dass der Ligand mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, um den Termitendarm bindet Protozoen und andere frei lebende Protozoen, aber nicht um Bakterien oder Darmgewebe. Wir zeigen auch, dass der gleiche Wirkstoff gekoppelt an eine lytische Peptid effizient tötet Termitendarm in vitro (Protozoen Kultur) und in vivo (Mikroinjektion in Enddarm der Arbeitnehmer) Protozoen, ist aber weniger bacteriacidal als die lytische Peptid allein. Der Verlust der Protozoen führt zum Tod der Termiten in weniger als zwei Wochen. In Zukunft werden wir genetisch Ingenieur Mikroorganismen, die in der Termite Enddarm und die Ausbreitung durch eine Termitenkolonie als &quot;Trojanische Pferde&quot; zu Ligand-lytische Peptide, die in der Termitendarm Protozoen zu töten und anschließend zu töten die Termiten in der Kolonie würde ausdrücken können überleben . Ligand-lytische Peptide auch nützlich sein könnte für die Entwicklung von Medikamenten gegen einzellige Parasiten.

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Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Wir präsentieren Verfahren für den Nachweis, dass Liganden binden an die Oberfläche Membran der Zellulose-Verdauung Protozoen im Darm von Termiten Formosan unterirdischen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und dass Liganden mit lytischen Peptiden gekoppelt töten diese Protozoen<em&gt; In-vitro-</em&gt; (Anaerobe Protozoen Kultur) und<em&gt; In vivo</em&gt; (Injektion in den Termiten Enddarm).

Testen Protozoacidal Aktivität von Ligand-lytische Peptide gegen Termite Gut Protozoen In-vitro- (Protozoen Kultur) und In vivo (Mikroinjektion in Termite Enddarm)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

testing-protozoacidal-activity-ligand-lytic-peptides-against-termite

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

14.8K Aufrufe.  Louisiana State University Agricultural Center. Wir präsentieren Verfahren für den Nachweis, dass Liganden binden an die Oberfläche Membran der Zellulose-Verdauung Protozoen im Darm von Termiten Formosan unterirdischen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und dass Liganden mit lytischen Peptiden gekoppelt töten diese Protozoen In-vitro- (Anaerobe Protozoen Kultur) und In vivo (Injektion in den Termiten Enddarm).

Serie: Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

Extrahieren von DNA aus dem Gut Mikroben der Termite (Zootermopsis Angusticollis) und visualisieren Gut Mikroben

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Forschung

Biologie

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft in der Termite Enddarm - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Schichten von Symbiosis - Visualisierung der Termite Enddarm mikrobiellen Gemeinschaft

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Testen der physiologische Barrieren für die virale Transmission in Blattläuse mit Mikroinjektion

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs are distinguished by a polyhedral lattice of clathrin that coats the vesicle membrane and serves as a mechanical scaffold. Clathrin coats are assembled during vesicle formation from individual clathrin triskelia , the soluble form of clathrin composed of three heavy and three light chain subunits7,8. Because the triskelion does not have the ability to bind to the membrane directly, clathrin-binding adaptors are critical to link the forming clathrin lattice to the membrane through association with lipids and/or membrane proteins9. Adaptors also package transmembrane protein cargo, such as receptors, and can interact with each other and with other components of the CCV formation machinery9.
Over twenty clathrin adaptors have been described, several are involved in clathrin mediated endocytosis and others localize to the trans Golgi network or endosomes9. With the exception of HIP1R (yeast Sla2p), all known clathrin adaptors bind to the N-terminal -propeller domain of the clathrin heavy chain9. Clathrin adaptors are modular proteins consisting of folded domains connected by unstructured flexible linkers. Within these linker regions, short binding motifs mediate interactions with the clathrin N-terminal domain or other components of the vesicle formation machinery9. Two distinct clathrin-binding motifs have been defined: the clathrin-box and the W-box9. The consensus clathrin-box sequence was originally defined as L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10 but variants have been subsequently discovered11. The W-box conforms to the sequence PWxxW (where x is any residue).
Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) was originally identified as an actin associated protein and is necessary for normal actin cytoskeleton structure and dynamics at endocytic sites in yeast cells12. Sla1p also binds the NPFxD endocytic sorting signal and is critical for endocytosis of cargo bearing the NPFxD signal13,14. More recently, Sla1p was demonstrated to bind clathrin through a motif similar to the clathrin box, LLDLQ, termed a variant clathrin-box (vCB), and to function as an endocytic clathrin adaptor15. In addition, Sla1p has become a widely used marker for the endocytic coat in live cell fluorescence microscopy studies16. Here we use Sla1p as a model to describe approaches for adaptor-clathrin interaction studies. We focus on live cell fluorescence microscopy, GST-pull down, and co-immunoprecipitation methods.

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-mediated endocytosis depends on adaptor proteins that coordinate cargo selection and clathrin coat assembly. Here we describe procedures to study adaptor-clathrin physical interaction and live cell imaging approaches using as a model the yeast endocytic adaptor protein Sla1p.

In vivo und in vitro Studien zur Adapter-Clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissektion der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Explantation Kultur oder<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Stimulation der DNA-Sensing Zytoplasmatische Pathways<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...