Agradecemos ao Dr. Allison Richard, ex-diretor da unidade peptídeo LSU para a síntese do ligante fluorescentes, o Centro de Pesquisa Interdisciplinaray Biotecnologia, UF para a síntese de peptídeos ligante-líticas, ea instalação de Microscópio Socolovsky para fornecer acesso a microscópios de fluorescência. O financiamento foi fornecido pelo Programa de Desenvolvimento SERDP exploratória (SEED) do Departamento de Defesa, Departamento de Energia e Agência de Proteção Ambiental, a Biotecnologia AgCenter Programa Equipe Interdisciplinar eo estado de Louisiana.

Experimento 1: Extração de intestino de cupins protozoários em condições anaeróbias <ol><li> Use uma caixa de ventilador (Laboratories Coy) em uma caixa de luva constantemente circular o ar através de um dessecante e D catalisador tipo Stak-Paks para controle de umidade e níveis de oxigênio e eliminar a temperaturas irregulares. Preencher o porta-luvas com um fluxo contínuo de nitrogênio por 20 a 30 min. Monitorar os níveis de oxigênio com um sensor de oxigênio (C-quadrado, Inc.) para 1 h. Uso de nitrogênio para alcançar e manter condições anaeróbicas, quando necessário. </li><li> Prepare Trager U media (Trager 1934) e ajustar o pH para 7,0. Sparge o meio filtrante esterilizada no porta-luvas com uma mistura de hidrogênio 2,5%, de dióxido de carbono de 5% e 92,5% de nitrogênio por 1 h para remover os resíduos de oxigênio. </li><li> Silanizadas todos os materiais, incluindo lâminas de microscópio, tubos de microcentrífuga, pipetas, copos etc utilizados nos experimentos usando Sigmacote para evitar a adsorção de protozoários ou peptídeos em superfícies (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / medialib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf). </li><li> Desde intestino de cupins protozoários são organismos estritamente anaeróbios que não deve ser exposto ao oxigênio. Portanto, as seguintes etapas são realizadas sob condições anaeróbicas em uma caixa de luva (ver 1.1). Com uma pinça de submergir todo o corpo de um trabalhador de cupins em etanol 70% e rode suavemente por cerca de 10 s para remover os contaminantes de superfície. </li><li> Remover o trabalhador a partir do etanol e deixe secar em um Kimwipe limpa para cerca de 20 s. Use uma solução estéril de ponta fina pinça para segurar o trabalhador abdômen e agarra a ponta do abdômen com um par de pinças para puxar suavemente o intestino cima ou para baixo em um ângulo de 45 graus. Se o intestino é puxado em um ângulo reto e com muita força, é provável que quebre. Coloque 10 guts em uma queda de 100 l media Trager U em uma lâmina de microscópio. </li><li> Pierce as entranhas com um par de sondas estéreis fina dissecação para liberar os protozoários e gentilmente transferir o conteúdo do intestino com uma pipeta de 200 mL em um tubo de microcentrífuga de 1 ml contendo 900 mL Trager U mídia. Depois de permitir a sedimentação dos fragmentos de parede do intestino (5 s), 900 mL de transferência do sobrenadante para um novo tubo. </li><li> Transferência de 10 ml de cultura de protozoários para uma lâmina de microscópio sigmacoted e verificar a condição de protozoários ao microscópio com 200 X de ampliação. </li><li> Prepare culturas controle do pyriformis Tetrahymena aeróbica protozoários, Amoeba sp., Euglena sp. E Paramecium sp. (Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC), bem como uma cultura overnight de Escherichia coli nos meios de cultura recomendados pelo fornecedor. </li></ol> Experimento 2: Adicionar ligante acoplado com um corante fluorescente para os protozoários e as bactérias culturas para testar para a ligação com as membranas de superfície e paredes celulares Nós usamos anteriormente bibliotecas phage display (New England Biolabs Inc, Ipswich, MA) para identificar seqüências de 19 heptapéptido que se ligam a protozoários (protocolos disponíveis em http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). Um ligante com uma seqüência de peptídeos (ALNLTLH) que mostrava semelhanças com glicoproteínas putativa conhecida da membrana Trypanosoma brucei foi sintetizado e acoplado a um C-terminal fluorescentes sonda (EDANS, 5 - ((2-aminoetil) amino) naftaleno-1-sulfônico ácido, λmax = 341 nm, λem = 471 nm) através de síntese de estado sólido peptídeo (SSPS), utilizando o EDANS resina NovaTag (EMD Biosciences). Aqui demonstramos que o ligante se liga ao protozoários que foram isoladas do intestino de cupins e outros protozoários de vida livre, mas não para bactérias. <ol><li> Cultura do protozoário, como descrito no experimento. 1. Fix protozoários com formol a 10% a 4 ° C por 12 h. </li><li> Centrifugar a solução protozoários (30 xg, 10 min), desprezar o sobrenadante e lavar o pellet contendo os protozoários fixos duas vezes em 1ml Trager U mídia. Re-suspender o sedimento em 1 ml Trager U mídia. Além disso, corrigir outros protozoários, e E. bactéria Escherichia para controles. </li><li> Incubar os microrganismos fixos por 1-2 h com solução de ligante sintetizado acoplado ao EDANS corante fluorescente (preparada em água) a uma concentração final de 50 mM. O ligante se dissolve melhor na água do que Trager U mídia. </li><li> Observe os microorganismos sob um microscópio de fluorescência em 400 X ampliação em um máximo de absorbância a 341 nm e uma emissão na região azul em 471 nm. </li></ol> Experimento 3: Teste de atividade protozoacidal do ligante acoplado a um peptídeo lítico in vitro (cultura de protozoários) A conjugada do ligante e do peptídeo lítico Hecate (Mutwiri et al. 2000) foi previamente sintetizado no Centro de Proteína LSU. <ol><li> Silanizadas materiais e preparar a cultura cupim gut protozoários no porta-luvas uma anaeróbias descritos no Exp. 1. </li><li> Prepare culturas de microrganismos aeróbios de controle (por exemplo, E. coli e as espécies de vida livre protozoário T. pyriformis). </li><li> No ambiente anaeróbio do porta-luvas, pipeta seis alíquotas de 198 mL de cultura de protozoários em tubos de 0,5 ml Eppendorf. Adicione 2 mL de uma solução de M-100 de ligante peptídeo lítico a metade das alíquotas (concentração de 1 mM final) da cultura do intestino de cupins protozoários. Adicione 2 mL de água para a outra metade das alíquotas (controles). </li><li> Na bancada, prepare alíquotas semelhantes de E. coli e T. pyriformis com um peptídeo lítico peptídeo M, ligando-líticas ou água. </li><li> Após 1 h, a transferência de 10 ml de cada cultura protozoários aos slides. Compare a sobrevivência dos protozoários tratados ao de controles em um microscópio com 200 X de ampliação. </li><li> Após 1 h, 100 mL placa de aprox. 10 -4 diluição do E. culturas coli em BHI e incubar a 37 ° C durante a noite. Compare o número de unidades formadoras de colônias nas placas. </li></ol> Experiência 4: Injeção do ligante acoplado a um corante fluorescente no intestino posterior para o cupim <ol><li> Puxar agulhas (Modelo GD-1, 1 X 900 mm) usando um PC-10 Narishige vidro extrator micropipeta com um nível de dupla fase de calor (65 e 48) para obter um tamanho da ponta de 20-30 mM. Confirmar o tamanho da ponta, medindo-lo sob um microscópio utilizando um micrômetro. </li><li> Preencher uma agulha com ca. 30 mL de 50 mM de ligante fluorescente marcados em suspensão na água usando uma seringa anexado. Encha uma outra agulha com água para o controle. Anexar uma micropipeta (0,5 mL de capacidade e 32 mm de comprimento, Drummond Companhia Científica) a um detentor de um micromanipulador. Coloque uma agulha para o titular sistema de injeção em um micromanipulador segundo. Definir os parâmetros de injeção inicial de cerca de 1 comprimento do pulso e 10-12 s injeção psi. Antecedência a agulha lentamente na micropipeta e injetar a solução com um pedal-driven de alta velocidade do sistema de injeção eletrônica com um controle comprimento de pulso ligado a um fluxo controlado de gás nitrogênio, o que garante que um volume constante é reproduzível injetado. Após a injeção, remova a micropipeta e gravar o comprimento da solução injetada usando um paquímetro Vernier. Calcular o volume injetado a partir dos parâmetros conhecidos da micropipeta. Ajustar a pressão de gás nitrogênio e do comprimento de pulso para expulsar 0,3 mL de solução em uma única injeção. </li><li> Aperte o fim de um abdômen trabalhador cupins com uma pinça macio para remover qualquer presente excreta no reto. Imobilizar trabalhador cupins pelo frio-los no gelo por 5 min. </li><li> Faça receptores para a realização de trabalhadores de cupins, cortando 100 ponteiras mL usando uma lâmina de bisturi. Cortar a ponta para um comprimento de 10-12 mm e usar de acordo com o tamanho de cupins. </li><li> Anexar o receptor para o micromanipulador. Coloque um trabalhador em uma placa de Petri de lado dorsal e aspire a cabeça primeiro trabalhador para o receptor usando uma bomba de sucção de azoto de modo que o término do trabalhador se projeta a partir do receptor. </li><li> Segurando o cupim no receptor, cuidadosamente antecedência a agulha cheia usando o micromanipulador para inseri-lo no ânus trabalhador. Injetar 0,3 mL da solução (ligante fluorescente marcado ou água para controles). </li><li> Colocam os trabalhadores injetados com ligante ou água em pratos separados petri com papel de filtro úmido e mantê-los em 26 ± 2 ° C com 78% RH </li><li> Extirpar entranhas da cupins injetado e recolher os protozoários após 24 h, como mostrado acima na Exp. 1. Fix e observar os protozoários, como mostrado na Exp. 2. </li></ol> Experiência 5: Teste de atividade protozoacidal do ligante acoplado a um peptídeo lítico in vivo (injecção de cupins hindgut) <ol><li> Silanizadas materiais, conforme descrito no experimento. 1. </li><li> Prepare uma solução M 500 do peptídeo ligante-lítica na água. </li><li> Siga os passos 3.1) através de 3.4) para preparar as agulhas de vidro, os receptores e os trabalhadores de cupins. </li><li> Seguindo os métodos descritos em 3.5) injetar 0,3 mL de solução de ligante-lítica de peptídeos (tratamento) ou água (controle) no intestino posterior de 20 trabalhadores de cupins. </li><li> Segure cupins por 24 h, coragem extirpar de vários trabalhadores e observar conteúdo estomacal sob o microscópio, como descrito em 3.6). e 3.7). </li><li> Assim a morte de protozoários no intestino de cupins é confirmado, manter restantes cupins tratados e controles em placas de Petri com papel de filtro úmido e observar mortalidade diária. </li></ol> Resultados representativos: Experimento 1: Normalmente, intestino anterior, intestino médio e intestino posterior são obtidas numa só peça, quando o procedimento é seguido corretamente (Figura 1a). Os protozoários residem em alta densidade nas porções anaeróbia do intestino grosso e pode ser liberado pela perfuração do intestino grosso com uma pinça (Figura 1b 1 e 2). O maior protoespécies zoa no intestino do cupim subterrâneo Formosan é o P. fusiformes grassii, que é de 200-300 mM de comprimento e 150 m de largura e pode ser visto a olho nu. A espécie é a segunda maior H. pear-shaped hartmanni (50-140 mM de comprimento e 30-80 m de largura). A menor espécie é o S. em forma de cone leidyi (15-50 mM de comprimento e 30/08 m de largura;. Lai et al 1983). As espécies de protozoários são mostrados na Figura 2. Sob condições de cultivo ideal das três espécies de protozoários isolada do intestino de cupins subterrâneos Formosa permanecerão vivos e saudáveis ​​por pelo menos 72 h em media U Trager anaeróbia (Figura 3a). No entanto, se as condições de cultura não são ideais protozoários vai morrer rápido. Se houver resíduos de oxigênio na mídia, o movimento de protozoários cessará imediatamente. Se a pressão osmótica é muito alta ou a integridade da membrana fica comprometida a membrana da superfície da protuberância vai para fora e protozoários a ruptura de células (Figura 3b). Se a pressão osmótica é muito baixo ou membranas são comprometidos, protozoários irá murchar e encolher (Figura 3c). Experimento 2: Nós confirmamos que o ligante acoplado a uma sonda fluorescente ligado a todas as três espécies de protozoários do intestino posterior de Formosan cupins subterrâneos em densidades detectável. Ligação do ligante ocorre na superfície de células inteiras (Figura 4). Sítios de ligação estão concentradas na região anterior do protozoário no axostyle (uma folha de microtúbulos) e núcleo em P. grassii. Observamos alguns autofluorescência irregular de partículas de madeira ingerida pelo protozoário. No entanto, autofluorescência é geralmente fácil de discernir de ligação específica do ligante, uma vez que não há autofluorescência da superfície, o axostyle eo núcleo (Figura 4). Nós também detectada fluorescência em todas as testadas de vida livre aeróbica espécies de protozoários (Figura 5), ​​o que sugere que o ligante se liga a estruturas genéricas para protozoários. No entanto, nenhuma ligação do ligante foi observado para E. coli. Experimento 3: Um mM de ligante-lítica de peptídeos matou todos os três espécies de protozoários do intestino de cupins de Formosa trabalhadores subterrâneos e T. de vida livre pyriformis in vitro em menos de 10 min, enquanto os controles permaneceram vivos. A Figura 6 mostra a perda progressiva da integridade da membrana do intestino de cupins protozoários tratados com ligante-lítica de peptídeos. Membranas bojo e ruptura, shrivel protozoários e morrer. Não foi observada diferença no número de E. colônias coli entre os tratamentos do ligante-lítica de peptídeos e água. Peptídeo lítico sem ligante, entretanto, reduziu o número de E. colônias coli consideravelmente (Figura 7). Isto sugere que a fixação do ligante, em certa medida protege os microorganismos não-alvo de lise. Experiência 4: 0,3 mL Quando 50 mM do ligante marcado fluorescente foi injetado no intestino posterior dos trabalhadores de cupins, a ligação a P. grassii, S. leidyi e H. hartmanni foi confirmado através de microscopia de fluorescência semelhante ao Exp. 2 (Figura 4). Cupim tecido intestinal não mostrou fluorescência. Experiência 5: A injeção de 0,3 mL 500 mM ligante-lítica de peptídeos matou todas as três espécies de protozoários no intestino de cupins subterrâneos Formosan dentro de 24h. Cupins morreram dentro de 10 dias após a perda de seus protozoários simbióticos. Anteriormente, Husseneder e Collier (2009) injetaram a mesma concentração de peptídeo lítico em tripas de cupins. Sem o ligante ligado, demorou mais tempo até que os protozoários no intestino (72 h) e os cupins foram mortos (seis semanas). Isto sugere que o ligante aumenta a eficiência protozoacidal de peptídeos lítico, muito provavelmente pela ligação dos peptídeos líticas para o protozoário. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. a: Formosa do intestino de cupins subterrâneos em um slide mostrando as principais seções do intestino (frente, médio, intestino grosso); b 1 e 2: intestino posterior é perfurada com uma pinça para liberar o conteúdo do intestino contendo os protozoários. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. As três espécies de protozoários flagelados encontrados no intestino posterior do cupim subterrâneo Formosan: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni, e c) Spirotrichonympha leidyi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Protozoários na cultura, uma saudável) protozoários, b) Protozoa com membranas abaulamento, c) encolhidas protozoários. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Confirmação da ligação do ligante acoplado a uma sonda fluorescente para cupim gutprotozoários (de cima para baixo: P. grassii, H. hartmanni, S. Leydi), tratados com ligante fluorescente marcado e controles não tratados (mostrando autofluorescência). <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Ligação do ligando a protozoários de vida livre aeróbica, a) Tetrahymena, b) Amoeba, c) Euglena, e d) Paramecium. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Tratamento de protozoários com água) (controle) e b) 1 mM ligante-lítica de peptídeos. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. E. colônias coli em placas (10 diluição -4): a) tratados com água (controle), b) tratados com 1 mM ligante-lítica de peptídeos, c) tratados com 1 mM peptídeo lítico.

<ol>
	<li>Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugates+of+lytic+peptides+and+LHRH+or+&#946;CG+target+and+cause+necrosis+of+prostate+cancers+and+metastases.">Conjugates of lytic peptides and LHRH or &#946;CG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).</li><li>Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paratransgenesis+for+termite+control.">Paratransgenesis for termite control.</a> Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically+engineered+bacteria+(Escherichia+coli)+to+monitor+ingestion,+loss+and+transfer+of+bacteria+in+termites.">Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites.</a> Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+termite+gut+bacteria+deliver+and+spread+foreign+genes+in+termite+colonies.">Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).</li><li>Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+antimicrobial+peptides+with+low+mammalian+cell+toxicity.">De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity.</a> J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).</li><li>Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+and+distribution+of+the+three+species+of+symbiotic+protozoa+in+the+hindgut+of+Coptotermes+formosanus+(Isoptera).">Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera).</a> Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).</li><li>Leuschner, C., Hansel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+disrupting+lytic+peptides+for+cancer+treatments.">Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments.</a> Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).</li><li>Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+Antimicrobial+Peptide,+d-Hecate,+on+Trichomonads.">Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads.</a> J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).</li><li>Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+a+cellulose-digesting+flagellate,+Trichomonas+termopsidis,+and+of+certain+other+termite+protozoa.">The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa.</a> Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ligante-lítica de peptídeos têm sido usados ​​com sucesso para efetivamente atacar e destruir as células cancerosas (Hansel e Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Com base neste conceito, foi desenvolvido um ligante heptapéptido que se liga à superfície de protozoários no intestino de cupins subterrâneos Formosan e acoplado a um peptídeo lítico com o objetivo de destruir estes obrigam-celulose digerir simbiontes no intestino de cupins para alcançar cupins controle (Husseneder e Collier 2009). </...

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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>SL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDANS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novabiochem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anaerobic glove box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coy Laboratories, Inc.</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intellus environmental controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Percival</td>
<td>I36NL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PC-10 Glass micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>PC-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>GD-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leitz micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vermont Optechs, Inc.</td>
<td>ACS01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research, Inc.</td>
<td>MINJ-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcaps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>1-000-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA fluorescence imaging system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMRxA2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMLB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>SZ61</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

testing protozoacidal activity of ligand-lytic peptides against termite gut protozoa in vitro (protozoa culture) and in vivo (microinjection into termite hindgut)

Estamos desenvolvendo uma nova abordagem para controle de cupins subterrâneos que levam a dependência reduzida sobre o uso de pesticidas químicos. Cupins subterrâneos são dependentes de protozoários do hindguts de trabalhadores de forma eficiente digerir madeira. Peptídeos líticas têm sido mostrados para matar uma variedade de protozoários parasitas (Mutwiri et al. 2000) e também protozoários no intestino do cupim subterrâneo Formosan, Coptotermes formosanus (Husseneder e Collier 2009). Líticas peptídeos são parte do sistema imune inespecífica dos eucariotos, e destruir as membranas de microrganismos (Leuschner e Hansel, 2004). Peptídeos mais lítica não são susceptíveis de prejudicar eucariotos superiores, porque eles não afetam o eletricamente neutro membranas contendo colesterol das células de eucariotos superiores (Javadpour et al. 1996). Ação peptídeo lítico pode ser direcionada para tipos específicos de células pela adição de um ligante. Por exemplo, Hansel et al. (2007) relataram que os peptídeos líticas conjugado com câncer de células ligantes do receptor de membrana pode ser usada para destruir as células do câncer de mama, enquanto peptídeos líticas isoladamente ou conjugados com os não-específicas peptídeos não foram eficazes. Líticas peptídeos também foram conjugados aos hormônios humanos que se ligam a receptores nas células tumorais para a destruição específica de células cancerosas da próstata e testicular (Leuschner e Hansel, 2004). Neste artigo apresentamos as técnicas utilizadas para demonstrar a atividade protozoacidal de um peptídeo lítico (Hecate) acoplado a um ligante que se liga a heptapéptido a membrana de superfície de protozoários no intestino do cupim subterrâneo Formosan. Essas técnicas incluem a extirpação do intestino de cupins trabalhadores, a cultura anaeróbica de intestino protozoários (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), a confirmação microscópica que o ligante marcadas com um corante fluorescente se liga ao intestino de cupins protozoários e outros protozoários de vida livre, mas não a bactérias ou tecido do intestino. Nós também demonstramos que o ligante mesmo acoplado a um peptídeo lítico eficiente mata intestino de cupins protozoários in vitro (cultura de protozoários) e in vivo (microinjeção no intestino posterior dos trabalhadores), mas é menos do que o bactericida peptídeo lítico sozinho. A perda de protozoários leva à morte dos cupins em menos de duas semanas. No futuro, iremos modificar geneticamente microorganismos que podem sobreviver no intestino posterior de cupins e espalhar através de uma colônia de cupins como &quot;Cavalos de Tróia&quot; para expressar-ligante líticas peptídeos que mataria o protozoário no intestino de cupins e, posteriormente, matar os cupins na colônia . Ligante-lítica peptídeos também podem ser úteis para o desenvolvimento de medicamentos contra parasitas protozoários.

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Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Apresentamos os procedimentos para demonstrar que ligantes se ligam à superfície da membrana de celulose de digestão destes protozoários no intestino de cupins subterrâneos Formosan por microscopia de fluorescência e que juntamente com peptídeos ligantes líticas matar protozoários<em&gt; In vitro</em&gt; (Cultura protozoários anaeróbios) e<em&gt; In vivo</em&gt; (Injecção no intestino posterior de cupins).

Atividade de testes Protozoacidal Ligand-lítica Peptídeos Contra Gut Termite Protozoa In vitro (Cultura Protozoa) e In vivo (Microinjeção em Termite intestino grosso)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

testing-protozoacidal-activity-ligand-lytic-peptides-against-termite

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

14.8K visualizações.  Louisiana State University Agricultural Center. Apresentamos os procedimentos para demonstrar que ligantes se ligam à superfície da membrana de celulose de digestão destes protozoários no intestino de cupins subterrâneos Formosan por microscopia de fluorescência e que juntamente com peptídeos ligantes líticas matar protozoários In vitro (Cultura protozoários anaeróbios) e In vivo (Injecção no intestino posterior de cupins).

Vídeo: Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

Extração de DNA a partir do Micróbios Gut da térmita (Zootermopsis Angusticollis) e Visualizing micróbios do intestino

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Biologia

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Investigando a comunidade microbiana no intestino grosso da térmita - Entrevista

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Camadas de Simbiose - Visualizando a térmita comunidade microbiana do intestino posterior

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Testando a barreiras fisiológicas para a transmissão viral em Aphids Usando microinjeção

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs are distinguished by a polyhedral lattice of clathrin that coats the vesicle membrane and serves as a mechanical scaffold. Clathrin coats are assembled during vesicle formation from individual clathrin triskelia , the soluble form of clathrin composed of three heavy and three light chain subunits7,8. Because the triskelion does not have the ability to bind to the membrane directly, clathrin-binding adaptors are critical to link the forming clathrin lattice to the membrane through association with lipids and/or membrane proteins9. Adaptors also package transmembrane protein cargo, such as receptors, and can interact with each other and with other components of the CCV formation machinery9.
Over twenty clathrin adaptors have been described, several are involved in clathrin mediated endocytosis and others localize to the trans Golgi network or endosomes9. With the exception of HIP1R (yeast Sla2p), all known clathrin adaptors bind to the N-terminal -propeller domain of the clathrin heavy chain9. Clathrin adaptors are modular proteins consisting of folded domains connected by unstructured flexible linkers. Within these linker regions, short binding motifs mediate interactions with the clathrin N-terminal domain or other components of the vesicle formation machinery9. Two distinct clathrin-binding motifs have been defined: the clathrin-box and the W-box9. The consensus clathrin-box sequence was originally defined as L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10 but variants have been subsequently discovered11. The W-box conforms to the sequence PWxxW (where x is any residue).
Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) was originally identified as an actin associated protein and is necessary for normal actin cytoskeleton structure and dynamics at endocytic sites in yeast cells12. Sla1p also binds the NPFxD endocytic sorting signal and is critical for endocytosis of cargo bearing the NPFxD signal13,14. More recently, Sla1p was demonstrated to bind clathrin through a motif similar to the clathrin box, LLDLQ, termed a variant clathrin-box (vCB), and to function as an endocytic clathrin adaptor15. In addition, Sla1p has become a widely used marker for the endocytic coat in live cell fluorescence microscopy studies16. Here we use Sla1p as a model to describe approaches for adaptor-clathrin interaction studies. We focus on live cell fluorescence microscopy, GST-pull down, and co-immunoprecipitation methods.

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-mediated endocytosis depends on adaptor proteins that coordinate cargo selection and clathrin coat assembly. Here we describe procedures to study adaptor-clathrin physical interaction and live cell imaging approaches using as a model the yeast endocytic adaptor protein Sla1p.

In vivo e in vitro de Estudos Adaptor-clathrin Interação

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Indução de hipóxia e Testes em Cultura de Células

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissecção<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crista neural para<em&gt; In vitro</em&gt; Cultura Explant ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Estimulação da Citoplasmáticas DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...