Estas estrategias sensibles se pueden utilizar para evaluar la eficacia de la inhibición de los inhibidores químicos y en combinación con la deleción del gen CRISPR-Cas9 para investigar los objetivos del fármaco. En lugar de utilizar un ensayo final, el crecimiento del parásito se puede monitorear con el tiempo para permitir el cálculo del tiempo de duplicación del parásito utilizando una proteína de reportero sensible. Este ensayo se puede ampliar potencialmente en microplacas de 384 o 1.536 pozos para la prueba de múltiples compuestos o para el cribado de bibliotecas de una manera de alto rendimiento.
Esta estrategia se puede modificar para cuantificar el crecimiento de otros patógenos microbianos intracelulares y sus respuestas a la droga de interés. Para realizar un ensayo de crecimiento de Toxoplasma basado en la luciferasa, comience por aspirar cuidadosamente el medio de cultivos de microplacas preseleccionados de 96 pozos de fibroblastos de prepucio y inocular 150 microlitros de suspensión del parásito B en los pozos en un formato de tres columnas y cinco filas. Después de una incubación de cuatro horas en la incubadora de cultivo celular, aspirar cuidadosamente el medio de cada pozo para eliminar los parásitos no invadidos y llenar los pozos en cada uno menos la primera fila con medio libre de fenol rojo a temperatura ambiente.
A continuación, agregue 100 microlitros de una solución de sustrato de luciferasa de 12,5 micromolares en PBS en cada pocómo de la fila superior e incubar las microplacas durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la lelisis de células completas. Al final de la incubación, mida la actividad de la luciferasa en un lector de microplacas. Cada lectura representa el número inicial de parásitos invadidos a las cuatro horas después de la infección.
Repita el análisis cada 24 horas durante los próximos cuatro días sin cambiar el medio. Para calcular el plegado-cambio normalizado del crecimiento del parásito, cada lectura se puede dividir por la lectura inicial en cuatro horas después de la infección. El registro 2 del ple change normalizado del crecimiento del parásito se puede trazar contra cada punto de tiempo y someterse a una función de regresión lineal para obtener la pendiente que representa el tiempo de duplicación.
Para evaluar la eficacia de la inhibición de un compuesto de interés en el crecimiento de Toxoplasma, cultivo de fibroblastos de foreskin humano en microplacas de 96 pomos durante al menos siete días antes de inocular cada pozo de células con 150 microlitros de parásitos como se demostró durante cuatro horas a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono. Durante la incubación, preparar el compuesto de interés en ocho concentraciones diferentes en un depósito de 12 pocódicos por dilución en serie. Diluir los compuestos en un depósito de 12 pocín a una dilución de uno a tres pipeteando cada mezcla varias veces con una pipeta de un mililitro.
A las cuatro horas después de la infección, reemplace el medio en cada pozo de las columnas dos a nueve con 150 microlitros de medio complementados con cada dilución del compuesto, dejando la primera columna llena con medio regular para servir como control no tratado. Luego devolver los cultivos celulares a la incubadora de cultivo celular durante 96 horas y medir la actividad luciferasa para cada pozo para determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento en los cultivos en cada concentración de compuesto. Para calcular la actividad de luciferasa normalizada como un porcentaje, dividir la actividad media de luciferasa para cada concentración compuesta por la actividad media de luciferasa derivada de los parásitos no tratados.
A continuación, utilice un programa de software gráfico adecuado para trazar las actividades de luciferasa normalizadas contra el compuesto individual y para calcular la concentración inhibitora media máxima para cada compuesto. Para generar una construcción de plásmido que exprese ARN de una sola guía y Cas9 para eliminar un gen de interés, navegue a la página Recursos genómicos de Toxoplasma y recupere toda la secuencia de codificación genética, incluidos los intrones y exones, junto con las regiones de 1,5 kilobases cinco y tres regiones no transferibles de primera. Copie la secuencia TgCPL recuperada en el software de análisis de secuencia y etiquete las cinco y tres regiones no traducibles principales.
En la página Recurso de Genómica de Toxoplasma, haga clic en Descargar, Archivos de datos y Current_Release. En la carpeta T.gondii GT1, seleccione FASTA. Desde la carpeta de datos, descargue el archivo de secuencia del genoma de deformación unitaria Toxoplasma gondii GT1.
A continuación, cree una carpeta local denominada Toxoplasma Genome en el software de análisis de secuencia de ADN e importe el archivo de secuencia del genoma toxoplasma en la carpeta. Seleccione Herramientas, Clonación y Buscar sitios CRISPR y establezca tres cas9 primos principales para la ubicación del sitio de PAM. Seleccione un ARN de una sola guía que demuestre una puntuación de alta especificidad, generalmente superior al 98% y carezca de una G después del NGG.
El ARN de una sola guía seleccionado generalmente se encuentra en sitios cercanos al inicio y detener los codones del gen de interés. A continuación, utilice una premezcla de PCR con los ajustes indicados en la tabla para realizar una reacción PCR para modificar el plásmido preexistente que expresa el ARN de una sola guía que se dirige al gen TgUPRT. Para la transfección de Toxoplasma, mezcle dos microgramos de ADN de plantilla reparado con 20 microgramos de los plásmidos de expresión de ARN Cas9 de una sola guía y mezcle 400 microlitros de resuspensión de parásitos, ADN y cinco microlitros de 200 milivolarios ATP 500 milivoltios reducidos de glutationa en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitas.
Añadir tampón de citomix para llevar el volumen total hasta 500 microlitros según sea necesario y transferir la mezcla de ADN del parásito a un espacio de cuatro milímetros con cubeta de electroporación. A continuación, electroporar los parásitos a dos kilovoltas y 50 ohmios de resistencia. Para clonar parásitos knockout, primero realizar una dilución de dos pasos de los parásitos para lograr un 10 parásitos por mililitro de medio D10 complementado con la concentración de antibióticos adecuada.
A continuación, transfiera 150 microlitros de los parásitos purificados resuspendidos a cada pocillo de una microplaca de 96 pocóculos presemmbrada con fibroblastos de prepucio e incubar la microplaca a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante siete días. Al final de la incubación, identificar los pozos que contienen una sola placa y transferir 75 microlitros de los fibroblastos humanos de foreskin infectados por Toxoplasma resuspendidos de cada pozo del cultivo de microplacas de 96 pozos a tubos individuales de 1,5 mililitros. Recoger las células por centrifugación y resuspender los pellets en 10,25 microlitros de tampón de lelisis que contiene tampón de dilución en el aditivo de liberación de ADN.
A continuación, incubar las muestras durante cuatro minutos a temperatura ambiente y dos minutos a 98 grados celsius antes de realizar la PCR para realizar pruebas de la integración del casete de resistencia a los fármacos y la pérdida del gen de interés. Las eficacias de inhibición de LHVS y el tipo salvaje en cepas de CPL delta se pueden determinar trazando sus actividades de luciferasa contra diferentes concentraciones de inhibidores. Después de la PCR, el plásmido mutado se linealiza y se carga en un gel de 1% de agarosa para la verificación de una amplificación exitosa.
Después de la extracción de gel y la transformación de E.coli, los clones que contienen los plásmidos esperados pueden ser examinados por la digestión de la endonucleasa de restricción en la secuenciación del ADN. Después de la amplificación de la plantilla de reparación, la electroforesis de gel de agarosa se puede utilizar para verificar el tamaño correcto del producto PCR. Generalmente, se seleccionan de siete a ocho clones para el cribado inicial para comprobar la eliminación de la secuencia de codificación del gen de interés, seguido de la detección de los cinco y tres brazos primos para ayudar a minimalizar el número total de clones a examinar.
La verificación adicional se puede completar inmunoblotting si hay algún anticuerpo que reconozca la proteína diana. Antes de obtener mediciones de actividad de la luciferasa, se debe revisar una microplaca transparente con una infección simulada bajo un microscopio para garantizar que los parásitos no licen completamente las células huésped.
