Nous remercions le Dr Allison Richard, ancien directeur de l&#39;établissement peptide LSU pour la synthèse ligand fluorescent, le Centre de recherche en biotechnologie Interdisciplinaray, UF pour la synthèse peptidique ligand-lytique, et l&#39;installation de microscope Socolovsky pour donner accès à des microscopes à fluorescence. Le financement a été fourni par le Programme de développement SERDP exploratoire pour demain (SEED) du ministère de la Défense, ministère de l&#39;Énergie et de l&#39;Environmental Protection Agency, le Programme de biotechnologie AgCenter équipe interdisciplinaire et l&#39;État de Louisiane.

Expérience 1: Extraction de l&#39;intestin des termites protozoaires dans des conditions anaérobies <ol><li> Utilisez une boîte de ventilateur (Laboratoires Cie) dans une boîte à gants de constamment circuler l&#39;air à travers un déshydratant et le type catalyseur D Stak-Paks de contrôler l&#39;humidité et les niveaux d&#39;oxygène et d&#39;éliminer les températures inégales. Remplissez la boîte à gants avec un flux continu d&#39;azote de 20 à 30 min. Surveiller les niveaux d&#39;oxygène avec un capteur d&#39;oxygène (C-squared, Inc) pendant 1 h. Utilisez l&#39;azote pour atteindre et maintenir des conditions anaérobies en cas de besoin. </li><li> Préparer Trager U médias (Trager 1934) et ajuster le pH à 7,0. Barbotage du média filtrant stérilisés dans la boîte à gants avec un mélange d&#39;hydrogène de 2,5%, de dioxyde de carbone de 5% et 92,5% d&#39;azote pendant 1 h pour enlever les résidus de l&#39;oxygène. </li><li> Silaniser tous les matériaux, y compris des lames de microscope, des microtubes, des pipettes, verrerie etc utilisés dans les expériences utilisant Sigmacote pour empêcher l&#39;adsorption des protozoaires ou des peptides aux surfaces (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / mediaLib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf). </li><li> Depuis l&#39;intestin des termites protozoaires sont des organismes anaérobies strictes qu&#39;elles ne doivent pas être exposés à l&#39;oxygène. Par conséquent, les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions anaérobies dans une boîte à gants (voir 1.1). Avec une pince à plonger tout le corps d&#39;un travailleur de termites dans l&#39;éthanol à 70% et mélanger doucement en tournant pendant environ 10 s pour enlever les contaminants de surface. </li><li> Retirez le travailleur de l&#39;éthanol et laisser sécher sur un Kimwipe propre pour environ 20 s. Utiliser une solution stérile à pointe fine pince pour tenir le ventre des travailleurs et de saisir l&#39;extrémité de l&#39;abdomen avec une autre paire de pinces pour tirer doucement l&#39;intestin vers le haut ou vers le bas dans un angle de 45 degrés. Si l&#39;intestin est tiré à un angle de droites et avec trop de force, il est susceptible de se briser. Placer 10 tripes dans une goutte de 100 médias ul U Trager sur une lame de microscope. </li><li> Pierce les tripes avec une paire de sondes stériles fines dissection pour libérer les protozoaires et doucement transférer le contenu de l&#39;intestin avec une pipette 200 pi dans un tube à centrifuger 1 ml contenant 900 ul Trager U médias. Après prise en compte de sédimentation des fragments de paroi intestinale (5 s), le transfert de 900 pi de surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Transférer 10 ul de la culture de protozoaires une lame de microscope sigmacoted et vérifiez l&#39;état des protozoaires sous un microscope à grossissement X 200. </li><li> Préparer les cultures de contrôle de l&#39;Tetrahymena pyriformis protozoaires aérobie, Amoeba sp. Euglena sp., Et la paramécie sp. (Carolina Biological Supply Company, Burlington, Caroline du Nord) ainsi que d&#39;une culture de nuit de Escherichia coli dans les milieux de culture recommandé par le fournisseur. </li></ol> Expérience 2: ligand Ajouter couplé avec un colorant fluorescent pour les protozoaires et les bactéries des cultures d&#39;essai pour la liaison aux membranes de surface et les parois cellulaires Nous avons déjà utilisé les bibliothèques phage display (New England Biolabs Inc, Ipswich, MA) pour identifier les 19 séquences heptapeptide qui se lient à des protozoaires (protocoles disponibles au http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf). Un ligand avec une séquence peptidique (ALNLTLH) qui a montré des similitudes avec les glycoprotéines putatives connue de la membrane Trypanosoma brucei a été synthétisé et couplé à une sonde fluorescente C-terminale (EDANS, 5 - ((2-aminoéthyl) amino) naphtalène-1-sulfonique acide, Xmax = 341 nm, = 471 nm λem) via la synthèse de peptides état solide (SSPS) en utilisant la résine EDANS NovaTag (EMD Biosciences). Ici nous démontrons que le ligand se lie à la protozoaires, qui ont été isolées de l&#39;intestin des termites et autres protozoaires vivant librement, mais pas pour les bactéries. <ol><li> Culture du protozoaires tels que décrits dans Exp. 1. Fixer les protozoaires avec le formaldéhyde 10% à 4 ° C pendant 12 h. </li><li> Centrifuger la solution protozoaires (30 xg, 10 min), éliminer le surnageant et laver le culot contenant les protozoaires fixes deux fois dans 1ml Trager médias U. Re-suspendre le culot dans 1 ml Trager médias U. En outre, fixer d&#39;autres protozoaires, et E. coli pour les contrôles. </li><li> Incuber les micro-organismes fixés pour les 1-2 h avec une solution de ligand synthétisé couplé à la EDANS colorant fluorescent (préparé dans l&#39;eau) à une concentration finale de 50 uM. Le ligand se dissout mieux dans l&#39;eau que Trager U médias. </li><li> Respecter les micro-organismes sous un microscope à fluorescence à 400 grossissement X à un maximum d&#39;absorbance à 341 nm et une émission dans la région bleue à 471 nm. </li></ol> Expérience 3: Test de l&#39;activité protozoacidal du ligand couplé à un peptide lytique in vitro (culture de protozoaires) Un conjugué de ligand et le peptide lytique Hécate (Mutwiri et al. 2000) a déjà été synthétisé à l&#39;installation de protéines LSU. <ol><li> Silaniser matériaux et de préparer l&#39;intestin des termites de la culture de protozoaires dans la boîte à gants anaérobies unes décrit dans Exp. 1. </li><li> Préparer des cultures de micro-organismes aérobies de contrôle (par exemple, E. coli et les espèces vivant librement protozoaires T. pyriformis). </li><li> Dans l&#39;environnement anaérobie de la boîte à gants, une pipette 6 aliquotes de 198 ul de la culture de protozoaires dans 0,5 ml de tubes Eppendorf. Ajouter 2 ul d&#39;une solution 100 uM de ligand peptide-lytique de la moitié des aliquotes (concentration finale 1 uM) de la culture l&#39;intestin des termites protozoaires. Ajoutez 2 l d&#39;eau à l&#39;autre moitié des aliquotes (témoins). </li><li> Sur la paillasse, préparer des aliquotes similaires de E. coli et de T. pyriformis avec 1 uM de peptide, lytique ligand-lytique peptide ou de l&#39;eau. </li><li> Après 1 h, le transfert 10 ul de chaque culture protozoaires aux diapositives. Comparer la survie des traités protozoaires à celle des témoins sous un microscope à grossissement X 200. </li><li> Après 1 h, la plaque 100 ul d&#39;env. Dilution 10 -4 de l&#39;E. coli sur les cultures BHI et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Comparer le nombre d&#39;unités formant colonie sur les plaques. </li></ol> Expérience 4: L&#39;injection du ligand couplé à un colorant fluorescent dans l&#39;intestin postérieur en termite <ol><li> Tirez aiguilles (modèle GD-1, 1 x 900 mm) en utilisant un Narishige PC-10 de verre extracteur micropipette avec un niveau de chaleur à deux étages (65 et 48) pour obtenir une taille de bout de 20-30 um. Confirmer la taille de la pointe en la mesurant au microscope en utilisant un micromètre. </li><li> Remplir une aiguille avec ca. 30 ul de 50 uM de ligand fluorescent marqué en suspension dans l&#39;eau en utilisant une seringue fixée. Remplir une autre aiguille avec de l&#39;eau pour le contrôle. Attacher une micropipette (0,5 microlitres et 32 ​​mm de longueur, Drummond Scientific Company) à un détenteur d&#39;un micromanipulateur. Fixer une aiguille pour le titulaire du système d&#39;injection dans un micromanipulateur secondes. Réglez les paramètres d&#39;injection initiale à environ 1 s longueur d&#39;impulsion et 10-12 psi d&#39;injection. Avancer l&#39;aiguille lentement dans la micropipette et injecter la solution en utilisant une pédale mécanique haute vitesse du système d&#39;injection électronique avec une durée d&#39;impulsion de contrôle attachée à un flux d&#39;azote gazeux contrôlé, ce qui assure un volume constant est reproductible injecté. Après l&#39;injection, retirez la micropipette et d&#39;enregistrer la longueur de la solution injectée en utilisant un pied à coulisse. Calculer le volume injecté à partir des paramètres connus de la micropipette. Régler la pression d&#39;azote gazeux et de la durée d&#39;impulsion d&#39;expulser 0,3 ul solution en une seule injection. </li><li> Pressez la fin de l&#39;abdomen des travailleurs contre les termites avec des pinces doux pour enlever toute présents excréments dans le rectum. Immobiliser des travailleurs contre les termites en les paralysant sur la glace pendant 5 min. </li><li> Faire des récepteurs pour la tenue de travailleurs contre les termites en coupant 100 embouts de pipette ul en utilisant une lame de scalpel. Couper l&#39;extrémité d&#39;une longueur de 10 - 12 mm et l&#39;utilisation en fonction de la taille de termites. </li><li> Connectez le récepteur à l&#39;micromanipulateur. Placer un ouvrier sur une boîte de Pétri sur sa face dorsale et aspirer la tête du premier travailleur dans le récepteur à l&#39;aide d&#39;une pompe d&#39;aspiration d&#39;azote pour que le terminus de la saillie à des travailleurs à partir du récepteur. </li><li> Tenir le termite dans le récepteur, soigneusement avancer l&#39;aiguille remplie à l&#39;aide du micromanipulateur pour l&#39;insérer dans l&#39;anus des travailleurs. Injecter 0,3 ul de la solution (ligand fluorescent marqué ou de l&#39;eau pour les contrôles). </li><li> Placez les travailleurs injecté avec un ligand ou d&#39;eau dans des boîtes de Petri séparées avec un papier filtre humide et les maintenir à 26 ± 2 ° C avec 78% HR </li><li> Extirper tripes de l&#39;termites injecté et de recueillir les protozoaires après 24 h comme indiqué ci-dessus dans Exp. 1. Fix et observer les protozoaires, comme indiqué dans Exp. 2. </li></ol> Expérience 5: Test d&#39;activité protozoacidal du ligand couplé à un peptide lytique in vivo (injection dans termites hindgut) <ol><li> Silaniser matériaux tels que décrits dans Exp. 1. </li><li> Préparer une solution 500 uM du peptide ligand-lytiques dans l&#39;eau. </li><li> Suivez les étapes 3.1) à 3.4) pour préparer des aiguilles de verre, des récepteurs et des travailleurs contre les termites. </li><li> Après les méthodes décrites dans 3.5) injectent 0,3 pi de solution de peptide ligand-lytique (traitement) ou de l&#39;eau (contrôle) dans l&#39;intestin postérieur de 20 travailleurs de termites. </li><li> Tenir les termites pendant 24 h, tripes extirper plusieurs travailleurs et d&#39;observer le contenu intestinal sous le microscope comme décrit dans 3.6). et 3.7). </li><li> Dès la mort de protozoaires dans l&#39;intestin des termites est confirmé, gardez restantes termites traités et les contrôles dans des boîtes de Petri avec du papier filtre humide et d&#39;observer la mortalité journalière. </li></ol> Les résultats représentatifs: Expérience 1: Habituellement, l&#39;intestin antérieur, moyen et postérieur sont obtenues en une seule pièce lorsque la procédure est suivie correctement (figure 1a). Les protozoaires résider dans la densité élevée dans les portions anaérobie de l&#39;intestin postérieur et peut être libéré en perçant l&#39;intestin postérieur avec une pince (1 figure 1b et 2). La plus grande protozoa espèces dans l&#39;intestin des termites souterrains de Formose est le P. fusiforme grassii, ce qui est de 200 à 300 um de long et 150 um de large et peut être vu à l&#39;œil nu. La plus grande espèce est la seconde forme de poire H. hartmanni (50-140 um de long et de 30 à 80 um de large). La plus petite espèce est la forme de cône S. leidyi (15-50 um de long et de 80 à 30 um de large;. Lai et al 1983). Les espèces protozoaires sont présentés dans la figure 2. Dans des conditions optimales de culture des trois espèces de protozoaires isolés de l&#39;intestin des termites souterrains Formose restera vivant et en bonne santé pendant au moins 72 h en anaérobie des médias Trager U (figure 3a). Cependant, si les conditions de culture ne sont pas optimales protozoaires mourra rapidement. S&#39;il ya des résidus de l&#39;oxygène dans les médias, le mouvement des protozoaires cessera immédiatement. Si la pression osmotique est trop élevée ou d&#39;une membrane d&#39;intégrité est compromise la membrane de surface du bulbe sera protozoaires et la rupture des cellules (figure 3B). Si la pression osmotique est trop faible ou les membranes sont compromis, les protozoaires se ratatiner et rétrécir (figure 3C). Expérience 2: Nous avons confirmé que le ligand couplé à une sonde fluorescente liée à tous les trois espèces de protozoaires de l&#39;intestin postérieur de Formose termites souterrains dans les densités détectable. La fixation du ligand se produit sur la surface de la cellule entière (figure 4). Des sites de liaison sont concentrés dans la région antérieure de la protozoaires sur le axostyle (une feuille de microtubules) et le noyau de P. grassii. Nous avons observé une certaine autofluorescence irrégulière de particules de bois ingéré par les protozoaires. Toutefois, l&#39;autofluorescence est habituellement facile à discerner, à partir liaison spécifique du ligand, car il n&#39;ya pas l&#39;autofluorescence de la surface, le axostyle et le noyau (figure 4). Nous avons également détecté par fluorescence dans tous testés vivant librement aérobie espèces de protozoaires (figure 5), ce qui suggère que le ligand se lie à des structures génériques pour les protozoaires. Cependant, aucun ligand n&#39;a été observée pour E. coli. Expérience 3: Un uM de ligand-lytique peptide tué tous les trois espèces de protozoaires de l&#39;intestin des termites souterrains travailleurs de Formose et le T. vivant librement pyriformis in vitro, en moins de 10 min, tandis que les contrôles est resté en vie. La figure 6 montre la perte progressive de l&#39;intégrité des membranes de l&#39;intestin des termites protozoaires traités avec le ligand peptide-lytique. Renflement des membranes et de la rupture, se ratatinent et meurent les protozoaires. Aucune différence n&#39;a été observée dans le nombre de E. coli colonies entre les traitements de ligand peptide-lytique et l&#39;eau. Peptide lytique sans ligand, cependant, réduit le nombre de E. colonies coli considérablement (figure 7). Ceci suggère que l&#39;attachement du ligand à un certain degré protège les microorganismes non cibles de la lyse. Expérience 4: Quand 0,3 ul 50 uM du ligand fluorescent marqué a été injecté dans l&#39;intestin postérieur des travailleurs contre les termites, la liaison à P. grassii, S. leidyi et H. hartmanni a été confirmée par la microscopie par fluorescence similaire à Exp. 2 (figure 4). Tissu intestinal Termite n&#39;a pas montré de fluorescence. Expérience 5: Injection de 0,3 ul 500 pM ligand-lytique peptide tué tous les trois espèces de protozoaires dans l&#39;intestin des termites souterrains Formose dans les 24h. Les termites sont décédés dans les 10 jours après la perte de leur protozoaires symbiotiques. Auparavant, Husseneder et Collier (2009) ont injecté la même concentration de peptide lytique dans les entrailles des termites. Sans le ligand fixé, il a fallu plus de temps jusqu&#39;à ce que les protozoaires dans l&#39;intestin (72 h) et les termites étaient morts (six semaines). Cela suggère que le ligand augmente l&#39;efficacité des peptides lytiques protozoacidal, probablement en se liant les peptides lytiques à l&#39;protozoaires. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. une gut Formose termites souterrains sur une diapositive montrant les principales sections de l&#39;intestin (avant-, mi-, hindgut); b 1 &amp; 2: Intestin postérieur est percé avec une pince pour libérer le contenu de l&#39;intestin contenant des protozoaires. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Les trois espèces de protozoaires flagellés trouvés dans l&#39;intestin postérieur des termites souterrains Formose: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni, et c) Spirotrichonympha leidyi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Les protozoaires dans la culture, une saine) protozoaires, b) les protozoaires avec des membranes bombées, c) flétri protozoaires. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Confirmation de la liaison du ligand couplé à une sonde fluorescente pour l&#39;intestin des termitesprotozoaires (de haut en bas: P. grassii, H. hartmanni, S. leydi), traité avec le ligand fluorescent marqué et les témoins non traités (montrant autofluorescence). <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Liaison du ligand à la vie libre protozoaires aérobie, a) de Tetrahymena, b) Amoeba, c) Euglena, et d) de la paramécie. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Traitement des protozoaires avec une eau) (contrôle) et b) 1 uM ligand peptide-lytique. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig7.jpg" alt="Figure 7" /> Figure 7. E. coli colonies sur des plaques (dilution 10 -4): a) traitées avec de l&#39;eau (contrôle), b) traités avec 1 uM de peptide ligand-lytique, c) traités avec 1 uM de peptide lytique.

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	<li>Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugates+of+lytic+peptides+and+LHRH+or+&#946;CG+target+and+cause+necrosis+of+prostate+cancers+and+metastases.">Conjugates of lytic peptides and LHRH or &#946;CG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).</li><li>Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paratransgenesis+for+termite+control.">Paratransgenesis for termite control.</a> Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically+engineered+bacteria+(Escherichia+coli)+to+monitor+ingestion,+loss+and+transfer+of+bacteria+in+termites.">Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites.</a> Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+termite+gut+bacteria+deliver+and+spread+foreign+genes+in+termite+colonies.">Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).</li><li>Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+antimicrobial+peptides+with+low+mammalian+cell+toxicity.">De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity.</a> J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).</li><li>Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+and+distribution+of+the+three+species+of+symbiotic+protozoa+in+the+hindgut+of+Coptotermes+formosanus+(Isoptera).">Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera).</a> Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).</li><li>Leuschner, C., Hansel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+disrupting+lytic+peptides+for+cancer+treatments.">Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments.</a> Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).</li><li>Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+Antimicrobial+Peptide,+d-Hecate,+on+Trichomonads.">Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads.</a> J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).</li><li>Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+a+cellulose-digesting+flagellate,+Trichomonas+termopsidis,+and+of+certain+other+termite+protozoa.">The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa.</a> Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).</li></ol>

Ligand-lytique peptides ont été utilisés avec succès pour cibler efficacement et de détruire les cellules cancéreuses (Hansel et Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Basé sur ce concept, nous avons développé un ligand qui se lie à heptapeptide la surface de protozoaires dans l&#39;intestin des termites souterrains de Formose et couplé à un peptide lytique dans le but de détruire ces n&#39;oblige digérer la cellulose-symbiotes dans l&#39;intestin des termites pour atteindre les termites contrôle (...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>SL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDANS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novabiochem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anaerobic glove box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coy Laboratories, Inc.</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intellus environmental controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Percival</td>
<td>I36NL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PC-10 Glass micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>PC-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>GD-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leitz micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vermont Optechs, Inc.</td>
<td>ACS01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research, Inc.</td>
<td>MINJ-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcaps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>1-000-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA fluorescence imaging system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMRxA2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMLB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>SZ61</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

testing protozoacidal activity of ligand-lytic peptides against termite gut protozoa in vitro (protozoa culture) and in vivo (microinjection into termite hindgut)

Nous développons une nouvelle approche de lutte contre les termites souterrains qui conduirait à réduire la dépendance à l&#39;utilisation de pesticides chimiques. Les termites souterrains sont dépendants des protozoaires dans le hindguts des travailleurs à digérer efficacement le bois. Peptides lytiques ont été capables de tuer une variété de parasites protozoaires (Mutwiri et al. 2000) et aussi des protozoaires dans l&#39;intestin des termites de Formose souterraines, Coptotermes formosanus (Husseneder et Collier 2009). Peptides lytiques sont partie du système immunitaire non spécifique des eucaryotes, et de détruire les membranes des microorganismes (Leuschner et Hansel 2004). La plupart des peptides lytiques ne sont pas susceptibles de nuire les eucaryotes supérieurs, parce qu&#39;ils n&#39;affectent pas les membranes cellulaires électriquement neutre contenant du cholestérol des eucaryotes supérieurs (Javadpour et al. 1996). L&#39;action lytique peptide peuvent être ciblées sur des types cellulaires spécifiques par l&#39;ajout d&#39;un ligand. Par exemple, Hansel et al. (2007) a rapporté que les peptides lytiques conjugués avec des ligands des récepteurs des cellules du cancer de membrane peuvent être utilisées pour détruire les cellules cancéreuses du sein, tandis que les peptides lytiques seul ou conjugué avec des non-peptides spécifiques n&#39;ont pas été efficaces. Peptides lytiques ont également été conjugué à des hormones humaines qui se lient à des récepteurs sur les cellules tumorales pour destruction ciblée de cellules cancéreuses de la prostate et des testicules (Leuschner et Hansel 2004). Dans cet article nous présentons les techniques utilisées pour démontrer l&#39;activité protozoacidal d&#39;un peptide lytique (Hecate) couplé à un ligand qui se lie à heptapeptide la membrane de surface des protozoaires de l&#39;intestin des termites de Formose souterraines. Ces techniques comprennent extirpation de l&#39;intestin des travailleurs contre les termites, la culture anaérobie de l&#39;intestin protozoaires (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), confirmation microscopique que le ligand marqué avec un colorant fluorescent se lie à l&#39;intestin des termites et autres protozoaires vivant librement protozoaires, mais pas à des bactéries ou tissu intestinal. Nous démontrons également que le même ligand couplé à un peptide lytique tue efficacement l&#39;intestin des termites protozoaires in vitro (culture de protozoaires) et in vivo (micro-injection dans l&#39;intestin postérieur des travailleurs), mais il est moins bactéricide que le peptide lytique seul. La perte de protozoaires conduit à la mort des termites en moins de deux semaines. Dans le futur, nous allons modifier génétiquement des micro-organismes qui peuvent survivre dans l&#39;intestin postérieur des termites et la propagation à travers une colonie de termites comme «cheval de Troie» pour exprimer ligand-lytique des peptides qui allait tuer les protozoaires dans l&#39;intestin des termites et ensuite tuer les termites de la colonie . Ligand-lytique peptides pourrait également être utile pour le développement de médicaments contre les parasites protozoaires.

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Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Nous présentons les procédures pour démontrer que les ligands se lient à la membrane de surface des ces protozoaires digérant la cellulose-dans l&#39;intestin des termites de Formose souterraines en utilisant la microscopie fluorescente et que les ligands couplés avec des peptides lytiques tuer les protozoaires<em&gt; In vitro</em&gt; (Anaérobie de la culture de protozoaires) et<em&gt; In vivo</em&gt; (Injection dans l&#39;intestin postérieur des termites).

Test activité Protozoacidal du ligand-lytique peptides contre Gut Termite protozoaires In vitro (Culture protozoaires) et In vivo (Microinjection dans Termite Intestin postérieur)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

14.8K vues.  Louisiana State University Agricultural Center. Nous présentons les procédures pour démontrer que les ligands se lient à la membrane de surface des ces protozoaires digérant la cellulose-dans l'intestin des termites de Formose souterraines en utilisant la microscopie fluorescente et que les ligands couplés avec des peptides lytiques tuer les protozoaires In vitro (Anaérobie de la culture de protozoaires) et In vivo (Injection dans l'intestin postérieur des termites).

Vidéo: Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

Extraction d&#39;ADN de l&#39;microbes de l&#39;intestin des termites (Zootermopsis Angusticollis) et Visualisation microbes de l&#39;intestin

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Recherche

Biologie

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Enquêter la communauté microbienne dans l&#39;intestin postérieur des termites - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Couches de Symbiose - Visualisation de la communauté microbienne Termite Intestin postérieur

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Test de la barrières physiologiques à la transmission virale chez les pucerons avec microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs are distinguished by a polyhedral lattice of clathrin that coats the vesicle membrane and serves as a mechanical scaffold. Clathrin coats are assembled during vesicle formation from individual clathrin triskelia , the soluble form of clathrin composed of three heavy and three light chain subunits7,8. Because the triskelion does not have the ability to bind to the membrane directly, clathrin-binding adaptors are critical to link the forming clathrin lattice to the membrane through association with lipids and/or membrane proteins9. Adaptors also package transmembrane protein cargo, such as receptors, and can interact with each other and with other components of the CCV formation machinery9.
Over twenty clathrin adaptors have been described, several are involved in clathrin mediated endocytosis and others localize to the trans Golgi network or endosomes9. With the exception of HIP1R (yeast Sla2p), all known clathrin adaptors bind to the N-terminal -propeller domain of the clathrin heavy chain9. Clathrin adaptors are modular proteins consisting of folded domains connected by unstructured flexible linkers. Within these linker regions, short binding motifs mediate interactions with the clathrin N-terminal domain or other components of the vesicle formation machinery9. Two distinct clathrin-binding motifs have been defined: the clathrin-box and the W-box9. The consensus clathrin-box sequence was originally defined as L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10 but variants have been subsequently discovered11. The W-box conforms to the sequence PWxxW (where x is any residue).
Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) was originally identified as an actin associated protein and is necessary for normal actin cytoskeleton structure and dynamics at endocytic sites in yeast cells12. Sla1p also binds the NPFxD endocytic sorting signal and is critical for endocytosis of cargo bearing the NPFxD signal13,14. More recently, Sla1p was demonstrated to bind clathrin through a motif similar to the clathrin box, LLDLQ, termed a variant clathrin-box (vCB), and to function as an endocytic clathrin adaptor15. In addition, Sla1p has become a widely used marker for the endocytic coat in live cell fluorescence microscopy studies16. Here we use Sla1p as a model to describe approaches for adaptor-clathrin interaction studies. We focus on live cell fluorescence microscopy, GST-pull down, and co-immunoprecipitation methods.

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-mediated endocytosis depends on adaptor proteins that coordinate cargo selection and clathrin coat assembly. Here we describe procedures to study adaptor-clathrin physical interaction and live cell imaging approaches using as a model the yeast endocytic adaptor protein Sla1p.

In vivo et in vitro de l&#39;adaptateur-clathrine Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

L&#39;activation de l&#39;apoptose par micro-injection cytoplasmique du cytochrome C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Stimulation de la cytoplasmiques ADN de détection Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo L&#39;électroporation et microinjection de testicule de souris

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...